流式细胞术原理及技术应用(新).pptVIP

流式细胞术的原理及其应用 流式细胞仪的主要组成部分： 流式细胞术是20世纪70年代发展起来的一种技术，有人将流式细胞仪比喻成高级的荧光显微镜。 目前，该技术以广泛用于生物及医学基础研究与临床检测，在分子生物学、免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学等领域内发挥着重要作用。 鞘液系统 光路系统 光学原理 抗体标记的方法 抗体的选择 首选直接标记抗体 荧光分子 PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原 间接标记 适用范围广, biotin-avidin不适合 弱抗原的检测 流式细胞分析的信息 Forward scatter(FSC) Side scatter(SSC) FL1-FITC FL2-PE FL3-PerCP PL4-APC 流式细胞的主要信息:Fluorescence FL1 FL2 FL3 FL4 Gating 流式常见图形 (Histogram Plot) 流式常见图形 (Dot Plot) 流式应用常见范围 细胞大小 细胞的颗粒度 细胞表面分子：CD 系列 细胞浆内分子：胞内细胞因子 细胞核内分子：P53 细胞功能检测：细胞周期、凋亡 其他（膜电位、钙离子浓度、核酸等） 实验对照的设计 空白对照：ALL 阴性对照：常用同型抗体对照 单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照 （用于仪器校正） 阳性对照：检测阴性时 实验标本的处理 单细胞悬液的制备： 物理法（剪碎法、 网搓法、研磨粉） 化学法（酶消化） 抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应 非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭－－血清和同型抗体 可用流式细胞仪分析的标本 外周血、骨髓、癌组织、癌旁组织、石蜡切片、各种体液（尿、脑脊液、胸腹水等） 待测标本 处理成单event悬液 荧光素标记的单抗染色 鞘液 经处理的细胞单个通过激光聚焦区 检测散射光、荧光 信号转化、放大 计算机数据处理 分选 SORTING（细胞分选） 分选速度 分选纯度 分选收获率 流式细胞术的应用 细胞死亡分两种：凋亡和坏死 细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。细胞发生凋亡时，就像树叶或花的自然凋落一样，借用希腊“Apoptosis”来表示，意思是像树叶或花的自然凋落，可译为细胞凋亡。 细胞凋亡与坏死的区别　　虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但它们的过程与表现却有很大差别。　　坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA 降解不充分，引起局部严重的炎症反应。　　凋亡是细胞对环境的生理性、病理性刺激信号，环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程。其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。 细胞凋亡的生物学意义 胚胎形成、肌体正常发育、衰老和损伤细胞的清除以及肿瘤的发生、发展和转归等都与细胞凋亡有关。 凋亡检测每一步都有检测试剂盒 1、半胱氨酸蛋白酶3检测法（早早期） 2、Annexin V-FITC/PI 法（早期） 3、Apo2.7检测法（早期） 4、TUNEL 法（晚期） 5、DNA含量分析法（晚晚期） 6、细胞凋亡相关基因的流式细胞术检测 亚二倍体峰（凋亡峰） --- PI staining不能区分凋亡与死亡细胞 Annexin V Assay建议用于悬浮细胞 Ann