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慢性氟中毒对公鸡睾丸组织细胞周期影响 　　摘要：通过研究慢性氟中毒对公鸡生精细胞细胞周期的影响，探讨慢性氟中毒对公鸡睾丸组织造成损害的机制。试验将36羽160日龄的三黄公鸡随机均分为染氟组、对照组，并进行常规饲养，对照组饮用自来水，染氟组饮用含量为3.25 g/L的NaF水。饲喂80 d后，采用流式细胞仪检测各组公鸡睾丸生精细胞的细胞周期变化。与对照组相比，染氟组公鸡睾丸生精细胞于S期数量减少，并于G0/G1期数量增多，且G1期与S期的细胞数量呈显著负相关关系。试验结果表明，染氟组公鸡睾丸生精细胞的细胞周期发生了显著改变。 　　关键词：氟中毒；公鸡；睾丸组织；细胞周期 　　中图分类号： S858.317.29 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0234-02 　　收稿日期：2014-10-29 　　基金项目：河南省商丘市科技计划（编号。 　　作者简介：郭全海（1980―），男，河南淮阳人，硕士，讲师，主要从事分子生物学、免疫学、动物疫病防治等方面的研究。E-mail：guohan611@163.com。 　　氟是动物机体必需的微量元素，但其化学性质活泼，安全范围窄，过量摄入可引起氟中毒[1]。长期以来，人们对氟的研究主要集中于其对骨骼、牙齿等骨相组织的损害，而非骨相方面的研究却很少。近年来有学者指出，慢性氟中毒可对机体非骨相组织造成很大损伤，已引起人们重视[2]。细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束的时间称为细胞周期，大量研究表明，氟化物可引起细胞周期的改变。采用细胞培养的方法观察氟对二倍体成纤维细胞周期的影响，发现氟对不同细胞非同步化培养的敏感性不同[3]。Hayashi等研究发现，细胞对氟的敏感性与细胞所处周期的不同时期有关[4]。氟可诱导啮齿类动物细胞染色体丝裂和断裂，表明氟对啮齿类动物细胞周期中的G2期敏感。氟可使大鼠卵巢、小鼠卵巢及子宫的DNA、RNA含量减少。体外细胞培养氟可抑制DNA的合成，表明氟可影响核酸、蛋白质的代谢[5]。国内外关于氟对机体影响的研究多集中于体外培养细胞、小鼠、大鼠等，而氟对公鸡睾丸组织细胞周期的影响尚未见报道。本研究在细胞生物学水平上探讨氟对睾丸组织细胞周期的影响，为相关疾病的治疗及研究提供理论参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验动物 　　36羽160日龄雄性三黄鸡购于商丘市梁园区某养鸡场，该鸡群曾对新城疫、传染性法氏囊炎、传染性支气管炎进行防疫，并对鸡球虫进行过防治。 　　1.2 主要试剂及仪器 　　氟化钠、75%乙醇、PI染液等购于南京凯基生物科技发展有限公司，自配PBS溶液。电子天平（上海天普分析仪器有限公司）、（江苏国胜实验仪器厂）、Epics-prolie型流式细胞仪（Coulter公司）、恒温水浴箱、低速离心机、涡旋振荡混合器、200目尼龙滤网、手术剪刀、镊子等。 　　1.3 试验动物模型建立 　　试验用公鸡经饲养观察无病后，随机分为试验组、对照组，每组18羽。2组均自由采食全价饲料（购于正大集团公司，含氟量符合国家标准）饲养。试验组自由饮用NaF含量为3.25 g/L的水；对照组自由饮用自来水（含氟量符合国家标准）。所有试验鸡均采用单笼饲养，试验期为80 d。 　　1.4 取样及单细胞悬液的制备 　　饲养第80天将试验鸡剖杀，于4 ℃环境下取出睾丸，剔除周围结缔组织，取每羽公鸡右侧睾丸采样，制备单细胞悬液，用于不同周期细胞比例的检测。剪取大小约为0.5 cm3的睾丸组织块，用眼科组织剪剪为1～2 mm大小的碎片，置于含3 mL PBS溶液（pH值为7.4）的试管内，于涡旋振荡混合器混合3 min后，用200目尼龙滤网过滤至另一试管内。将睾丸组织单细胞悬液以1 500 r/min离心5 min后弃上清，加入3 mL PBS溶液并混匀1 min，于同样条件重复洗涤离心2次即制成单细胞悬液，保存备用。 　　1.5 睾丸组织细胞周期的测定 　　采用流式细胞仪PI染色法测定睾丸组织细胞周期。用PBS溶液冲洗单细胞悬液2次，将细胞浓度调整为106个/mL，加入75%乙醇于4 ℃固定1 h，使用PBS溶液冲洗2次后，每管依次加入PBS溶液100 μL、PI染液300 μL，置于4 ℃避光环境中反应30 min。采用Epics-prolie型流式细胞仪检测细胞周期，计算不同倍体细胞亚二倍体峰所占的比例。 　　2 结果与分析 　　2.1 鉴定慢性氟中毒试验模型 　　试验第28天，试验组公鸡开始出现鸡冠变紫、头下耷、精神委顿、食欲不振、羽毛粗糙等症状；试验第73天左右，试验组大量公鸡卧地不起，表明鸡慢性氟中毒模型建立成功。 　　2.2 睾丸组织不同周期细胞的比例 　　分别将试验组、对照组的公鸡