6分子生物学研究法下基因功能研究技术er95a6ol.pptVIP

* 基因敲除技术 完全基因敲除 条件型基因敲除 1、完全基因敲除 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。 * 基本原理: 构建与靶基因同源 (10～15kb)的载体 外显子插有新霉素抗性基因 （neor）作为正选择的标志 疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因作为负选择 体外培养 新霉素(G418)和致死核苷类似物(GANC)作双重筛选 将重组体导入ES细胞 存活的ES细胞 * 方法 表型分析 构建载体 同源重组 筛选X被敲除的ES细胞 显微注射 回交得到X被敲除的动物 * 2、条件型基因敲除 条件型基因剔除是指某一特定细胞类型或细胞发育的特定阶段剔除某一特定基因的技术。 常用的条件型基因敲除有： 噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统 酵母细胞的FLP/FRT系统、R/RS系统 * 构建打靶载体 同源重组 筛选中靶ES 显微注射 杂交删除neor基因 特定阶段诱导Cre酶 切除目的片段 动物观察分析 Cre-loxP 重组系统进行条件性基因剔除的程序： 体外培养 * 基因敲除技术的应用 1、研究基因调控和基因功能； 2、建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供材料； 3、改造动物基因型，鉴定新基因和/或其新功能，研究发育生物学； 4、治疗遗传病，即基因治疗。 5、改造生物、培育新的生物品种。 * 6.3.1 酵母单杂交法 酵母单杂交（yeast one－hybrid system)是一项常用于研究DNA与蛋白之间的相互作用的方法。 特点：通过该方法可以识别稳定结合于DNA上的蛋白质，可在酵母细胞内研究真核生物DNA与蛋白之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。 6.3 蛋白质及其RNA相互作用技术 * 转录激活结构域 （activation domain，AD） DNA结合结构域 （DNA binding domain，BD） 基本原理： 顺式作用元件 报告基因得到表达 激活Pmin启动子 真核生物转录因子基本构件 * 基本操作过程为: cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD）融合 导入酵母细胞 基因产物 （蛋白质） 顺式作用元件 激活Pmin启动子 报告基因得到表达 筛选阳性克隆 测序分析 cDNA替换了编码结合结构域(BD)蛋白基因 * 应用领域： 主要用于确定某个DNA分子与某个蛋白质之间是否存在相互作用； 用于分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功能编码基因； 验证反式转录调控因子的DNA结合结构域； 准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序列。 * 6.3.2 酵母双杂交系统 酵母双杂交系统（Yeast two－hybrid system）巧妙地利用了真核生物转录调控因子的组件式结构（modular）特征，因为这些蛋白质往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中DNA结合结构域（DNA binding domain，BD）和转录激活结构域（activation domain，AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。单独的BD能与特定基因的启动区结合，但不能激活基因的转录，而由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。 * 酵母双杂交技术的基本原理 已知蛋白编码基因X 编码BD基因 cDNA不同片段Y 编码AD基因 诱饵 猎物 转化酵母细胞 报告基因 表达 不表达 X与Y编码蛋白有无相互作用 有 无 * * Dicer酶 双链RNA siRNA （21 ～25个核苷酸的小片段双链RNA） siRNA中的反义链指导合成一种被称为RNA诱导的沉默复合体（RISC）的核蛋白体 切割目的mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域 RISC 6.3.2 RNA技术及其应用 * RNAi技术的应用： 与传统的同源重组基因敲除技术相比 高稳定性 高效率 易于操作 可实现多种基因突变 主要用于基因功能研究或基因治疗 * RNAi技术的优缺点 RNAi最根本的特点是特异性 RNAi具有特殊的穿越能力,如将双链RNA注射在线虫性腺里,它也会干扰到体细胞里的基因表达,而且干扰作用会传给后代; RNAi对一些低水平表达的基因的RNAi现象并不明显,而且几个有相同或相似序列的基因, RNAi也会同时作用与它们. * 反义RNA 反义RNA是由基因的负链编码,可与正义RNA (sense RNA)或DNA 编码顺序结合,干扰mRNA 的转录,加工和转运,调控基因的表达. * 构建反义RNA 表达载体: 将全目的基因或部分目的基因反向插入表达载体 → 转化目标生物 →获得转基因个体或品系 → 分析转基因植株在生理、生化、形态等方面的变异 → 判别目的基因的功能 * 正义表