龙葵总碱研究探究 跟基质金属蛋白酶-药品招商-医药招商-药品招.docVIP

我公司相关资料 龙葵总碱作用机理之最新研究——基质金属蛋白酶 肿瘤，尤其是恶性肿瘤，是引起人类死亡的主要疾病之一。在原发灶的远处组织形成转移灶的能力（即转移的能力）是高度恶性肿瘤的一个重要特征，而肿瘤的转移性也是癌症引起死亡的主要原因。对于绝大多数原发灶肿瘤细胞来说，其中只有一小部分具有转移能力。这些具有高度转移能力的细胞具有以下几种特性：脱离原发肿瘤组织，向淋巴管或血管中迁移，穿过血管基底膜，穿透血管腔，逃脱免疫监视，与远离原发灶器官的血管内皮细胞粘附，离开血管（extravation）,在被侵入的微环境中存活和生长。现在的观点认为基质金属蛋白酶（matrix metallo proteinases,MMP）在肿瘤侵袭和转移过程中起重要作用。MMP在肿瘤侵袭转移中的作用曾一度被认为只是破坏基底膜及ECM中的其他部分。现已确认MMP在肿瘤演进的多个阶段均有作用，它影响肿瘤的起始、生长、血管生成、进入血管/离开血管和转移。因此，研究抗肿瘤药物对MMPs的影响，对研究药物的抗肿瘤转移方面具有重要意义[1].关于龙葵中生物碱对肿瘤细胞MMPs的影响，尚未见报道。本次实验，我们建立小鼠Lewis肺癌移植瘤模型，观察龙葵总碱对MMP-9基因mRNA表达的影响，初步探讨其抗肿瘤转移的作用机理。 实验材料： 1、药材与试剂： 龙葵总碱,6mg/瓶，由吉林市卓怡康纳制药有限公司提供，批号A549、LLC肿瘤株，由南京中医药大学惠赠；注射用环磷酰胺（CTX），江苏恒瑞医药股份有限公司，批号生理盐水，南京小营制药厂，批号：2005052505；戊巴比妥钠，中国医药（集团）上海化学试剂公司（进口分装），批号： 2、实验动物： C57BL/6J小鼠，♀，6-8周龄，由南京大学模式动物中心提供，生产许可证：2005-0002. 3、实验仪器： GS-15R台式冷冻离心机（Beckman）;DK-8D电热恒温水浴槽（上海精宏实验设备有限公司）；CO2培养箱（Forma scientific）;Pureplus纯水器（U.S.A）;SW-CJ-1FD净化工作台（苏净集团安泰公司）；Leica-DMIL型倒置显微镜（Leica）;MP12001电子天平，上海市恒平科学仪器有限公司；AR2140型电子分析天平，奥赛斯国际贸易（上海）有限公司。 4、实验条件： 给药前后，小鼠分笼饲养，用全价颗粒饲料（由江宁青龙山动物繁殖场提供）喂养；温度20-25℃，湿度40-60%。 5、统计方法： 本实验量反应资料采用方差分析，统计软件用SPSS13.0。IC50计算LOGIT法。 实验方法： 取接种Lewis肺癌14天的C57BL/6J荷瘤小鼠，脱颈椎处死，无菌条件下取瘤组织，按肿瘤质量（g）与生理盐水（ml）1：3制备匀浆液，500转/分钟离心5分钟，弃上清，用生理盐水调整细胞数1×106/ml备用，取C57BL/6J小鼠40只，分别于右腋皮下接种匀浆液，每只0.2ml（细胞数2×105）。接种后每日观察小鼠，等小鼠肿瘤长出，体积约为1cm3时，按肿瘤体积将上述小鼠随机分为5组：生理盐水（saline）组、龙葵总碱（SNSA）低、中、高剂量组和环磷酰胺（CTX）组。分组后每组给予相应药物。龙葵总碱低、中、高剂量组剂量分别为2、4、8mg/kg，腹腔注射，连续给药5天。环磷酰胺60mg/kg，每隔7天给药一次。生理盐水组注射同体积生理盐水。第14口脱颈椎处死各组小鼠，取皮下瘤块，迅速放入液氮中保存，待测MMP-9基因mRNA表达[2-4]。 用RT-PCR法检测Lewis肺癌组织MMP-9基因表达。检测方法如下： （1）耗材处理：0.1%DEPC水浸泡组织匀浆管、1.5ml离心管、0.6ml离心管、1000μl、100μl、10μl枪头等过夜。弃DEPC水，高压蒸汽灭菌组织匀浆管、1.5ml离心管、0.6ml离心管、1000μl、100 主要试剂：RNAiso为TAKARA产品，RT-PCR试剂盒为PROMEGA产品，dNTPs、MgCl2、rTaq PCR聚合酶、PCR DL2000 Marker为TAKARA产品，其余试剂为进口分装。 （2）大鼠组织提取总RNA及纯度鉴定： ①取材：每组分别随机6各组织（模1、2、4、5、7、8；阳1、3、4、6、7、8；高1、2、3、4、5、6；中1、2、3、4、6、8；小1、2、3、4、5、7），切取约50-100mg组织/管。 ②每管加入1mlRNAiso试剂，匀浆器中进行匀浆至无组织碎片，移入1.5ml离心管中。室温静置10min。台式高速冷冻离心机（美国IEC公司，MP4R） ③每管加入0.2ml氯仿，小心盖上盖子，有力振荡混合液15s，室温放置5min。 ④4℃、