抵抗素基因420CG位点多态性对脑出血患者血浆抵抗素浓度影响.docVIP

抵抗素基因420CG位点多态性对脑出血患者血浆抵抗素浓度影响 　　[摘要] 目的：探讨抵抗素基因-420CG位点单核苷酸多态性对脑出血患者血浆抵抗素水平的影响。方法：选取344例高血压性基底节出血患者，入院时抽取外周血提取DNA，采用聚合酶反应-限制性片断多态性分析基因型，同时采用ELISA法检测血浆抵抗素浓度，进行统计分析。结果：酶切后可见抵抗素基因-420CG位点有CC、CG和GG三种基因型，等位基因C和G的频率分别为71.08% 和28.92%，基因型CC、CG和GG的频率依次为为50.29%、41.57% 和8.14%。经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，各基因型频率符合遗传平衡。CC、CG和GG基因型患者血浆抵抗素浓度依次为（23.83±7.09）ng/mL、（26.54±7.32）ng/mL和（27.18±9.97）ng/mL。CC基因型患者血浆抵抗素均显著低于CG和GG基因型患者（PG位点单核苷酸多态性显著影响脑出血患者血浆抵抗素浓度，可能参与脑出血炎症反应。 　　[关键词] 抵抗素基因多态性脑出血炎症反应 　　中图分类号：R743.34文献标识码：A文章编号：1009-816x 　　抵抗素是一种首先发现由白色脂肪细胞分泌的肽类激素，可表达于脑外伤及脑缺血动物脑皮层，参与炎症反应[1, 2]。我们最近研究发现，脑出血患者血浆抵抗素水平升高，且与预后显著相关[3]。抵抗素基因启动子区-420CG位点单核苷酸多态性可以影响抵抗素基因启动子的活性，增加血液及组织中抵抗素的表达，从而影响其生物学效应[4-8]，但其与脑出血相关研究少见报道。本研究运用限制性内切酶方法，对抵抗素基因-420CG位点进行多态性分析，旨在揭示抵抗素基因-420CG位点多态性对脑出血后血浆抵抗素浓度的影响，为脑出血继发性脑损伤研究提供遗传学基础。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料： 脑出血病例选自2007年1月至2009年12月杭州市第一人民医院和慈溪市第二人民医院神经外科收治的高血压性基底节出血患者，共344例。脑出血病例一般情况及临床资料见表1，均除外既往脑卒中、使用抗凝剂、严重感染、严重心肝肾疾病及严重头部外伤史。 　　1.2 方法： 脑出血病例静脉血在入院时获得。血标本立即放入无菌EDTA试管中，在4℃、1500转/分、离心20分钟收集血浆，储存在-70℃环境中待检。ELISA法测定血浆抵抗素浓度，试剂购于美国RD systems公司。使用美国Stratagene公司生产的DNA提取试剂盒提取脑出血患者外周血DNA，利用PCR-RFLP法分析抵抗素基因-420CG位点基因多态性。根据人抵抗素基因特异序列设计引物，上游引物5-TGT CAT TCT CAC CCA GAG ACA-3，下游引物5-TGG GCT CAG CTA ACC AAA TC-3，扩增片段长度534bp，由上海生物工程有限公司合成。PCR扩增试剂盒为美国MBI fermentas 公司生产，共20 μl，含0.1 mmol/L dNTP、1 U Taq DNA 聚合酶、MgCl22 mmol/L、上下游引物各 0.25 μmol/L、DNA模版约 200 ng。PCR反应条件：95 ℃ 变性7 min，64 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共循环35次，末次循环后72 ℃再延伸10 min。取扩增产物3 μl，用限制性内切酶BbsⅠ（为美国NEB公司产品）5 U对PCR扩增产物在37 ℃下酶切12 h。将酶切产物点样于琼脂糖凝胶电泳，紫外线灯下观察结果、摄片，分析基因型。 　　1.3 统计学处理： 采用SPSS 10.0版统计软件分析，计量资料行正态检验，正态分布数据以（平均值±标准差）表示，采用方差分析。非正态分布数据以中位数（上四分位数，下四分位数）表示，采用Kruskal - Wallis H test检验。分类资料比较和Hardy-Weinberg平衡采用卡方检验。P0.05为差异有统计学意义。 　　 　　2. 结果 　　 　　 　　2.1 抵抗素基因-420CG位点多态性分析： 脑出血病例PCR产物均可见预期的534 bp的片段。经限制性内切酶BbsⅠ对PCR扩增产物进行酶切后产物电泳共获得3种基因型，CC型：缺乏BbsⅠ酶切位点，酶切后仅见与PCR产物一样的534 bp的片段；GG型：含有Bbs Ⅰ酶切位点，酶切后可见327 bp 和207 bp两条片段；CG型：杂合型，酶切后可见534 bp、327 bp 和207 bp 3条片段。脑出血病例等位基因C和G的频率分别为71.08% 和28.92%，基因型CC、CG和GG的频率依次为为50.29%、41.57% 和8.14%，经Hardy-Weinb