重氮衍生化试剂的合成及其在lcmsms法测定前列腺素含量中的应用-synthesis of diazo derivatization reagent and its application in determination of prostaglandin content by lcm sms method.docxVIP

汕头大学医学院硕士学位论文 汕头大学医学院硕士学位论文 I I 摘 要 前列腺素含量测定方法已经被大量报道，主要的方法包括 HPLC，GC-MS，EIA，RIA， LC-MS 等。其中不乏高灵敏度的方法，但在实际应用中发现很多缺点，如结构类似的前 列腺素交叉反应，样品前处理太过复杂，分析时间过长以及回收率较低等。因而对前列腺 素分析方法的优化始终是一个需要解决的重要问题。 通过比较已报道的前列腺素检测技术和样品前处理技术的优缺点，本项研究工作建立 了柱前衍生化结合高效液相色谱-串联质谱测定生物样品中的前列腺素 E2 的分析方法。 本项研究设计并首次合成了适合质谱检测的具有高离子化效应的前列腺素衍生化试剂 ——4-吡啶重氮甲烷。其合成路线是 4-(氨基甲基)吡啶经磺酰化、氧化，最后在强碱作用 下分解制得。通过比较反应物不同配比、溶剂、反应温度以及时间等，探索出较好的合成 条件和合成工艺。合成产物经核磁共振 (NMR )、质谱 (MS) 和红外 (IR) 进行结构确认， 与所设计的结构相符。 优化了生物样本的固相萃取方法，比较了不同洗脱剂的洗脱效果，确定了前列腺素与 所合成的衍生化试剂 4-吡啶重氮甲烷的化学反应条件等。最终所建立的分析方法如下： 脑组织匀浆液经 C18 固相萃取小柱纯化，乙醚洗脱，40 ℃水浴与 4-吡啶重氮甲烷反应 10 min，高效液相色谱分离，质谱检测；液相色谱流动相为甲醇-10 mmol/L 乙酸铵水溶液 （75:25，v/v），流速 0.2 ml/min；质谱采用电喷雾电离源，多离子反应监测方式进行检测； 分析物荷质比为 444→110。结果表明，前列腺素 E2 在 0.65 pmol ~ 7.10 pmol 范围内与检 测信号呈现出良好的线性关系, R2 为 0.996；方法检测限为 0.21 pmol；相对回收率在 70% 以上，日内相对标准差小于 6.8%，日间相对标准差小于 9.8%。 关键词：液相色谱-串联质谱法，前列腺素, 衍生化法；重氮化合物 II II ABSTRACT Many methods have been developed for quantitative determination of PGs including enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), gas-chromatography mass spectrometry (GC-MS), high performance liquid chromatography (HPLC), and liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS). Although some of them are sensitive enough for determination of PGs in different matrices, some shortcomings have been found in their applications, such as cross-reactivity with structurally related compounds, multi-step sample preparation, time-consuming and low recovery and so on. So optimization of analysis methods is always an important area of research. Therefore, the method for the determination of prostaglandin E2 in biological samples after derivatization was developed by high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. A high ionization efficiency derivatization reagent — 4-diazomethylpyridine was first designed and synthesized in our laboratory and used as a derivatization reagent for PGs. 4-Diazomethylpyridine was synthesized from 4-(aminomethyl)pyridine by reaction steps of sulfonylation, oxidation, a