第二代测序技术-罗氏454焦磷酸测序技术.PPT

仔猪肠道微生物菌群的研究 目录 仔猪的肠道微生态 仔猪肠道菌群的形成 肠道菌群的研究方法进展 第二代测序技术-罗氏454焦磷酸测序技术 实验进展及后续实验计划 仔猪的肠道微生态 仔猪肠道微生物区系随宿主日龄增加逐渐变得复杂多样，且形成一个相对动态平衡、稳定的微生态系统，对宿主的生长和健康起着重要作用。但报道认为，自然界中很多微生物不能用现有的培养方法进行分离和鉴定或是不能培养[1,2]，而且仔猪肠道中大部分微生物的生长需要厌氧环境，因此人们对仔猪肠道及粪样微生物及其变化规律的了解甚少。 仔猪肠道菌群的形成 新生动物肠道菌群形成可以划分为以下几个阶段[3,4,5,6]。 第一阶段:新生动物出生两周以内，肠道内的细菌定植方式基本相同。结肠内首先出现杆菌和肠链球菌，随之很快出现双歧杆菌并成为优势菌，这个时期肠道菌群的特点是不稳定，容易发生变化。 第二阶段:出生后两周到断奶以前，动物在母乳喂养下，肠道内细菌主要以厌氧菌为主，主要为双歧杆菌，肠杆菌和链球菌数量较少。这个阶段的特点是肠道菌群容易受食物的影响，食物的微小改变就可以引起肠道菌群发生较大的变化。 第三阶段:断奶以后，基本类似与成年动物肠道菌群。 肠道菌群的研究方法进展（常规分离培养技术） 在肠道微生物学研究中，科学家们通常使用一定的选择性液体或固体培养基，对粪便或肠道粘膜、肠道内容物等样本进行培养和富集，并对培养得到的细菌种类进行分析[7]。根据肠道细菌的特性，对肠道菌进行培养通常需要在厌氧的条件下进行，严格的厌氧和培养基的选择对于肠道菌的分离和生长具有非常重要的意义。 但是，局限于纯培养的方法具有很多不足之处。首先，体外培养体系难以模拟微生物在肠道中自然生长繁殖的条件，因此绝大多数的肠道微生物都还不能通过纯培养的方法得到分离；其次，仅仅依靠形态学和生理生化检测也不能对菌株进行准确的鉴定[8]。因此，在研究肠道菌群结构和功能的研究中，研究者们通常结合分离培养方法和分子生物学方法，对感兴趣的细菌种类进行研究。 肠道菌群的研究方法进展（分子生态学研究方法） 分子生态学方法通常以环境中各种微生物的基因组核酸（DNA 或 RNA）为研究对象。在以肠道菌群为对象的分子生态学研究中，研究者们最常使用核糖体小亚基RNA 基因（细菌中的 16S rRNA 基因）的全部或部分序列作为分子标签来代表物种，以基因序列的多样性代表物种的多样性，从而对菌群的组成结构进行分析。细菌 16S rRNA 基因具有广泛性、进化变异小、具备高保守区和高变区（V 区）等特点，同时序列还具有信息量巨大且更新迅速的公开数据库，如 Ribosomal Database Project（RDP）、SILVA 、Greengenes 等等，研究者们可以方便地将自己研究中的 16S rRNA基因序列与数据库进行比对，确定细菌的分类地位[9]。 常用的分子生态学分析方法分为两大类：基于 DNA 指纹图谱的分析方法和基于DNA 测序技术的分析方法。除此之外，可用于实时定量的荧光定量 PCR（Real time quantitative PCR）和荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization, FISH）也是常用的分析手段。 肠道菌群的研究方法进展（分子生态学研究方法） DNA 指纹图谱技术依据分子大小、核酸序列等特征的不同，将代表微生物群落中各物种的 DNA 分子标记物在凝胶上进行电泳分离，使代表不同物种的分子标记迁移到胶上的不同位置，最终得到的电泳图谱用于显示群落的组成结构。DNA 指纹图谱的最大优点是方便、快速、直观，常用于检测微生物群落结构的动态变化或比较不同群落之间的结构差异。最常用的 DNA 指纹图谱技术包括变性梯度凝胶电泳（Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）[10,11,12]和末端片段长度多态性（Terminalrestriction fragment length polymorphism, T-RFLP）等。 不同于指纹图谱技术，DNA 测序技术的目的在于通过直接获取序列核酸信息的方法，对群落中各物种的进化地位作出判断。基于单克隆质粒、转化细胞构建和桑格（Sanger）双脱氧法测序的 16S rRNA 基因克隆文库长期以来广泛用于研究群落中微生物组成的方法。 第二代测序技术-罗氏454焦磷酸测序技术 焦磷酸测序法的原理 将PCR扩增的单链与引物杂交,并与DN