紫外光纳米银引起的胁迫刺激下rnr基因调控变化的分析-analysis of rnr gene regulation changes under stress stimulated by ultraviolet silver nanoparticles.docxVIP

万方数据 万方数据 湖 南 大 学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究 所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包 含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出 重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到 本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1、保密□,在______年解密后适用本授权书。 2、不保密□√。 (请在以上相应方框内打 作者签名： 日期： 年 月 日 导师签名： 日期： 年 月 日 I 紫外光/ 紫外光/纳米银引起的胁迫刺激下 RNR 基因调控变化的研究 II万方数据 II 万方数据 摘 要 核苷酸还原酶是人体内催化 dNTP 从头合成途径的唯一限速酶，对于细胞内 dNTP 库的调控非常重要，而人体细胞增殖、DNA 损伤修复都需要稳定的 dNTP 供应才能实现，精确的 dNTP 库调控对于细胞的正常生理活动以及基因组稳定非 常重要。本论文主要进行了两个方面的工作： 核苷酸切除修复是人体细胞内进行 DNA 损伤修复的重要方式，而通常其中发 挥 DNA 损伤识别功能的 XPC 蛋白还具有对许多基因转录的调控功能，为了探究 XPC 蛋白是否参与调控核苷酸还原酶基因的转录，进而发挥对 dNTP 库的调控作 用，实验使用了 XPC 蛋白突变的 XP-C 细胞株与正常胚肺成纤维细胞 MRC-5 细胞 株。细胞经紫外光照射处理后，通过荧光定量 PCR 和 Western Blot 方法检测核苷 酸还原酶三种亚基 hRRM1、hRRM2 与 p53R2 的转录与蛋白水平，发现 XPC 蛋白 突变的细胞中 hRRM2 的转录明显增加，而在正常细胞中则没有增加；此外也检测 了与 hRRM2 的转录调控相关的 Rfx1 与 E2F1 基因的转录水平，发现 E2F1 可能参 与了 hRRM2 的转录调控。最后用 MRC-5 细胞使用染色质免疫沉淀技术发现 XPC 蛋白主要通过与 hRRM2 的启动子结合而抑制 hRRM2 的转录。 银纳米颗粒作为药物及日常用品的成分应用越来越广泛，咖啡因是咖啡等饮品 及多种药物的主要成分。本论文在用 HeLa 细胞系摸索并得到了银纳米颗粒与咖啡 因共同处理的最佳条件后，使用 MRC-5 细胞与非小细胞肺癌 H1299 细胞株为材料， 从分子生物学的角度探讨了银纳米颗粒与咖啡因对细胞的复合作用。实验首先验 证了核苷酸还原酶亚基 hRRM1、hRRM2 与 p53R2 的转录、p53 与 MDM2 的转录、 细胞凋亡途径 E2F1、Bax 与 Apaf1 的转录、ROS 消除相关的 SOD1、SOD2 与过 氧化氢酶的转录以及与细胞周期相关的 p21 和 CyclinD1 的转录，发现咖啡因无论 是否在银纳米颗粒的存在下都能抑制 hRRM2、E2F1 的转录，促进 Bax、Apaf1、 SOD1、SOD2、过氧化氢酶与 p21 的转录，而 SOD2 的转录明显是随着银纳米颗 粒的浓度增加而加强。另外发现银纳米颗粒能够促进核苷酸还原酶的 hRRM1 和 hRRM2 亚基的表达，但咖啡因可以明显抑制。使用 MG132 处理细胞后，hRRM1 的蛋白水平没有恢复，说明咖啡因对 hRRM1 的抑制作用并非通过蛋白酶体 途径； 而咖啡因对 hRRM2 在 MRC-5 细胞中的抑制也并没有因 MG132 的处理而回升，但 对 H1299 细胞使用 MG132 处理后，hRRM2 则表达量增加，这说明 p53 可能涉及 到 hRRM2 的降解的调控。 关键词：DNA 损伤应答；XPC 蛋白；核苷酸还原酶；dNTP 库；银纳米颗粒；咖啡因 硕士学位论文 硕士学位论文 PAGE VI PAGE VI 万方数据 Abstract The ribonucleotide reductase (RNR) is the only crucial enzyme catalyzing the dNTP synthesis from de novo pathway in human cells, which is momentous for the regulation of dNTP pool. The stability of dNTP pool serves the foundation of c