大鼠海马神经元的培养及细胞培养注意事项gq8llc1b.docxVIP

成年大鼠海马神经元的培养 步骤 获得海马细胞 大鼠乙醚麻醉，断头处理； 迅速解剖海马组织，置于含有2ml 4℃的HibernateA/B27的35mm的培养皿中； 随后将其移入含有同上培养基的培养皿，去除脑膜及多余的脑白质（？）； 将海马移入组织切碎机冷处理台面上事先用HibernateA/B27润湿的滤纸上，沿海马长轴将组织切成0.5mm的薄片，随后将其移入含有5ml4℃的HibernateA/B27的离心管中； 30℃震荡8min。 大吸管将其移入含有木瓜蛋白酶（预热至30℃）的离心管，置于170rpm的旋转平台（保持组织片悬浮状态），30℃水域温育30min； 将海马组织切片移入15ml含有2mlHibernateA/B27的离心管中，30℃温育5min，吸管吹打10次（30s），静置2min，将上清移入另一离心管，重复上述步骤2次； 梯度分离 将细胞悬液加入Nycoprep gradient（4ml）的上方，室温，1900rpm，离心15min；去除最上方的碎片；吸管收集含有细胞的部分；用5mlHibernateA稀释；第三层富含神经元；将第四层用2 ml B27:NeurobasalA重悬，1100rpm离心1min； 盖玻片处理：50ug/mL多聚-D-赖氨酸（无菌水溶解）包被过夜，吸去多余的多聚赖氨酸，无菌水漂洗一次，自然干燥1h； 细胞接种：以目标密度稀释于B27:NeurobasalA，以每盖玻片60到120 Ul 接种，置于5% CO2:9% O2中孵育1h； 将盖玻片移入24孔培养板中,每孔以0.4ml 37℃ B27/NeurobasalA漂洗一次，去除未贴壁细胞及细胞碎片；改用0.4ml的生长培养基； 培养后4天，每3-4天更换一半培养基；新的培养基中的FGF2含量是远培养基的2倍； 培养器皿的准备： 溶液瓶——装配各种溶液——输液瓶； 螺口瓶——血清或培养基； 培养瓶——细胞培养——一般采用带螺口的，清洗时注意防止盖子中垫片的丢失； 培养皿——细胞组织的分离、培养、染色——包括直径为30mm、60mm、120mm 血球细胞计数板——细胞计数 移液管——连接上手动（吸耳球）或电动负压吸取装置——在移液管尾部塞入少量脱脂棉； 离心管——分离、漂洗、收集细胞——一般选用螺口带盖的；Eppendorf——塑料尖底带盖的离心管 磁力搅拌器：用于神经细胞的分离机溶液的配置；最好配合使用可调温度的加热装置；可用高压蒸汽消毒。 加样器：微量加样器——一般采用紫外线消毒：超净台内，30cm，20~30min；移液器吸嘴置于移液器吸嘴盒中高压消毒。 培养板（塑料 消毒密封装备的即用型）——盖板及带圆孔的底板； 无菌室操作规范： 使用无菌间前先用无菌间的紫外灯照射30min，然后打开通风装置30min以消除实验室中的臭氧。操作结束后及时清理无菌间，紫外灯照射20min。 进入无菌间前洗手，带好口罩、手套，更换无菌间的鞋子、衣服方可进入 超净台操作规范： 超净台使用前先用70~75%酒精擦拭，然后用超净台的紫外灯消毒30min，关灯打开风机后使用；使用完成后及时清理台面并用酒精擦拭台面； 超净台内不放与实验无关的东西； 超净台内非一次性物品都需灭菌处理，不能高压灭菌的用70%-75%的酒精消毒； 操作人员的手套用70%-75%的酒精消毒方可进入超净台操作； 操作时尽量接近酒精灯；拿取吸管时避免接触使用端；不要在开口器上方操作；吸取不同液体用不同的吸管；吸管不接触瓶口；培养用吸管、培养瓶等开口常规在酒精灯上过火； 常用仪器的使用： 电热干燥箱: 用于玻璃器皿的消毒，而塑料、橡胶制品及金属器械不用于干热消毒 干热消毒的温度一般为160-170℃；用于RNA实验的器皿为250℃； 进行消毒后，鼓风和升温同时开始，待温度升至100℃时，关闭鼓风；消毒结束后，待温度降至100℃以下时打开箱门； 消毒完成后，将灭菌处理的器皿置于56℃电热干燥箱内长期保存 CO2培养箱 将不透气的培养瓶/培养皿置于培养箱时，应旋松螺口使之与外界气流相通维持PH的恒定；取出是应旋紧开口； 保持培养箱内空气的洁净，定期用酒精或紫外线消毒； 保持培养箱内较高的湿度——定期在外箱内加水或将无菌潮湿的纱布置于托盘内； 高压蒸汽灭菌器——适用于玻璃器皿、塑料器皿、橡胶制品、金属制品及培养用水、平衡盐液、布料的消毒灭菌。 灭菌的液体应置于耐高温的玻璃器皿中，容量为总容量的1/2~3/4，瓶塞要有通气口； 培养用液： 水 培养用水一般使用三蒸水，或者二蒸水+去离子处理；高压蒸汽灭菌后使用； 新鲜使用，一般不超过2周； 外购的蒸馏水一般为金属蒸馏器制备，一般需要用石英或玻璃蒸馏器在蒸馏一次 平衡盐： 取材和分离细胞中，细胞必须全程维持于生理PH和渗透压的平衡盐液中；