改进型RSS培养基体外培养结肠小袋纤毛虫效果研究.docVIP

改进型RSS培养基体外培养结肠小袋纤毛虫效果研究 　　摘要:利用实验生态学的方法，研究了结肠小袋纤毛虫在改进型RSS培养基中种群增长情况，结果发现，培养基中适宜的淀粉含量为20~30mg/安瓿，血清含量为20%~25%，适宜的pH值范围为7.0~7.5。 　　关键词:结肠小袋纤毛虫;改进型RSS培养基;种群自然增长率 　　中图分类号:S852.72+4文献标识码:A文章编号:1007-273X(2009)10-0006-03 　　 　　 　　结肠小袋纤毛虫病(Balantidiosis)是由结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)引起的人畜共患寄生虫病，呈世界性分布，主要流行于热带和亚热带地区。目前已知包括人在内的33种动物可以感染该病，人感染结肠小袋纤毛虫病后在临床上可表现为腹痛、腹泻、里急后重等症状，有些病例还可表现为泌尿生殖道感染，对人体健康危害较大[1，2]。猪结肠小袋纤毛虫感染非常普遍，感染率可高达20%~100%[3]。据研究，人的感染类型主要是猪―人，患者都有与猪密切接触史[4]。目前，国内外对结肠小袋纤毛虫的研究主要集中在流行病学的调查、临床病例的诊断和治疗等方面，而对结肠小袋纤毛虫生物学特性研究还不深入，虽然有人用由洛克氏液、米粉、小牛血清、青霉素、链霉素组成的RSS培养基进行体外培养的研究，但米粉需要自制，粒度大小难以掌握，为此，本课题用可溶性淀粉(化学纯)代替米粉组成改进型RSS培养基，探索结肠小袋纤毛虫在改进型RSS培养基上生长发育的基本规律，为进一步研究结肠小袋纤毛虫其他生物学特性和体外药敏试验打下基础。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1虫种采自洛阳市孟津县某猪场自然发病的病猪粪便，直接镜检发现有大量滋养体，未见包囊。取粪便样少许接种于RSS培养基，在28℃条件下培养48h，镜检后发现大量活动滋养体后用于试验研究，不用于试验时进行传代转接。 　　1.1.2试剂氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾等均为分析纯;灭活小牛血清;可溶性淀粉。 　　1.1.3仪器恒温培养箱，高压灭菌锅，小安瓿，试管，温度计，显微镜，电子天平，笔式酸度计等。 　　1.2方法 　　1.2.1洛克氏液(Ringer液)配制[4]洛克氏液配方为氯化钠8g，氯化钾0.2g，氯化钙0.2g，氯化镁0.01g，磷酸氢二钠2g， 磷酸二氢钾0.3g，蒸馏水1 000mL。配制时，先将氯化钙配成10%的溶液，将氯化镁配成1%的溶液，其余试剂直接溶解于蒸馏水，高压灭菌。临用前，取1mL的1%氯化镁和2mL的10%的氯化钙加入已配好的其余试剂配成的溶液中。 　　1.2.2RSS培养基的制备[11]取经严格清洗和灭菌的小安瓿一个，根据试验的具体要求加Ringer液、灭活小牛血清、可溶性淀粉、青霉素、链霉素，之后盖上胶盖备用。 　　1.3试验设计 　　1.3.1不同可溶性淀粉含量的改进型RSS培养基培养效果观察取经严格清洗和灭菌的小安瓿12个，每个小安瓿内加入Ringer液2.4mL、灭活小牛血清0.6mL、青霉素和链霉素各1万U/mL。之后分成A、B、C、D 4组，每组3个平行样品。A组每个样品中加入可溶性淀粉10mg，B组加20mg，C组加30mg，D组加40mg。将做成的培养基放入28℃恒温箱内平衡20min，之后将备用的滋养体接种于小安瓿内，每个小安瓿内接种量一致。检查初始密度后，将小安瓿加盖后放入28℃条件下培养，每12h(0.5d)检查1次，直至虫体密度下降为止。检查时，每一个样品取40μL，滴于载玻上，盖上盖玻片，置于100倍镜下检查，计数30个视野下的滋养体数，每次记录组内3个平行样品的平均数。 　　1.3.2不同血清含量的RSS培养基培养效果观察取经严格清洗和灭菌的小安瓿12个，分为A、B、C、D 4组，每组有3个平行。A组每个小安瓿内加入Ringer液2.7mL、灭活小牛血清0.3mL(占总体积10%)、可溶性淀粉20mg、青霉素和链霉素各1万U/mL;B组每个小安瓿内加入Ringer液2.55mL、灭活小牛血清0.45mL(占总体积15%)、可溶性淀粉20mg、青霉素和链霉素各1万U/mL;C组每个小安瓿内加入Ringer液2.4mL、灭活小牛血清0.6mL(占总体积20%)、可溶性淀粉20mg、青霉素和链霉素各1万U/mL;D组每个小安瓿内加入Ringer液2.25mL、灭活小牛血清0.75mL(占总体积25%)、可溶性淀粉20mg、青霉素和链霉素各1万U/mL。每个小安瓿内接种量一致。培养和观察方法同上。 　　1.3.3不同接种量的培养效果观察取经严格清洗和灭菌的小安瓿12个，每个小安瓿内加入Ringer液2.4mL、灭活小牛血清0.6mL、可溶