《吉林省食品安全地方标准 动物源性食品中沙门菌环介导等温扩增检测方法》（征求意见稿）.docVIP

DBS22 吉林省地方标准 DBS22/015—2013 食品安全地方标准 动物源性食品中沙门菌 环介导等温扩增检测方法 （送审稿） FORMTEXT - FORMTEXT XX - FORMTEXT XX发布 FORMTEXT XXXX - FORMTEXT XX - FORMTEXT XX实施 吉林省卫生厅发布 附件5 DBS22/015—2013 PAGE \* MERGEFORMAT I 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。 本标准的附录A是规范性附录，附录B是资料性附录。 本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。 本标准起草人：邵洪泽、王楠、苏双、石春军、刘芳、邢国明、李文东、程荣华、蒋云岩、白翠、许尧。 吉林省食品安全地方标准 动物源性食品中沙门菌环介导等温扩增检测方法 警告 警告─使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 范围 本标准规范了沙门菌环介导等温扩增检测方法。 本标准适用于肉、蛋、奶等动物源性食品中沙门菌的鉴定。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.4—2010 食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 术语及定义 下列术语和定义适用于本标准。 沙门菌属（Salmonella） 沙门菌属是一群寄生于人和动物肠道内的一大群形态、生化性状及抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌。无芽胞，无荚膜，多数细菌有周身鞭毛和菌毛，有动力，生化特性和抗原构造相似，需氧或兼性厌氧的一类细菌。 环介导等温扩增技术（loop mediated isothermal amplication，LAMP) 环介导等温扩增技术是针对靶基因的6 个区域设计4 种特异引物，利用一种链置换DNA 聚合酶在等温条件（63 ℃左右）保温30 min-60 min，即可完成核酸扩增反应。扩增产生的特异性产物量大，肉眼、电泳或比浊仪均可判度结果，适于病原检测。 试剂与材料 特异性引物 根据沙门菌STN基因，设计LAMP检测引物，浓度与序列，见表1。 特异性引物浓度及序列 引物种类 引物名称 浓度 核苷酸序列 外引物 F3 2.5 μmol/L 5-CCTTTCCCGCTATCGGTAAC -3 B3 2.5 μmol/L 5- GGATGCCCAAAGCAGAGAG -3 内引物 FIP 20 μmol/L 5 -GGCCGCCAGGGAACGATTAG-TGATGATAACGCGGTCGGT-3 BIP 20 μmol/L 5-TTCAACAGCACCTGAGTCAGCC-TTCACGGCGAATGAGACG-3 环引物 LF 10 μmol/L 5 -CGTAGAGGCAAAAGAAAGTGGG-3 LB 10 μmol/L 5 -TGTCCGGGTCAGCCTGA-3 试剂 培养基 缓冲蛋白胨水（BPW）增菌液：见附录A中A.1。 亚硒酸胱氨酸（SC）增菌液：见附录A中A.2。 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见附录A中A.3。 DNA抽提试剂 DNA抽提试剂如下： TE缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，1 mmol/L EDTA，pH8.0）：见附录A中A.4； 10%（W/V）十二烷基硫酸钠（SDS）； 20 mg/mL蛋白酶K； 5 mol/L氯化钠（NaCl）溶液； CTAB-NaCl溶液（10%CTAB，0.7 mol/L NaCl）； 氯仿-异戊醇（24：1，V/V）； 酚-氯仿-异戊醇（25：24：1V/V）； 异丙醇； 70%乙醇：见附录A中A.5。 LAMP试剂 LAMP试剂如下： 10×Bst DNA聚合酶缓冲液（200 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L KCl，100 mmol/L (NH4)2SO4，20 mmol/L MgSO4，1% Triton-100，pH8.8，25℃） 25 mmol/L MgCl2； 10 mmol/L dNTPs混合物：包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP； 8 U/μL Bst DNA聚合酶； 5 mol/L Betaine； 灭菌双蒸水。 其他试剂 DNA染料溴化乙锭（EB）或其替代品，10 mg/mL溴化乙锭：见附