医学生物所推荐省科技奖公示项目-云南省卫生计生委.doc

PAGE PAGE 14 医学生物所推荐省科技奖公示项目 拟推荐申报项目壹 一、项目类别 科学技术进步奖 二、项目名称 云南省人乳头瘤病毒分子分型及致癌基因核酸定量检测技术建立应用 三、项目基本情况 项目简介： 感染人乳头状瘤病毒（HPV）是导致宫颈癌的一个重要因素。宫颈癌在全球每年新发病例约50万，死亡例数约25万，在妇科肿瘤中发病率居第2位。HPV主要感染皮肤以及粘膜鳞状上皮，分为2大类，皮肤型和粘膜型。粘膜型主要感染人泌尿生殖道的黏膜上皮, 导致与泌尿生殖器官相关的多种疾病。根据与癌症发生的关系大小，粘膜型HPV分为高危型（HR）和低危型（LR）。高危型主要有HPV-16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和66型；低危型主要有HPV-6，11，40，42，43，44，54，61，70，72，81型。分子流行病学和病毒学研究发现，HPV感染宫颈可发展为宫颈癌，与HPV型别有关。在不同国家和地区HPV感染率及其型别分布存在差异，具有很强的地域性,其与宫颈癌相关的型别、E6/E7基因变异情况也不同。关于宫颈癌疫苗的研究，预防性疫苗主要以L1基因为主，治疗性疫苗主要以E6/E7基因为靶点。到目前为止，对于人乳头状瘤病毒(HPV)在西南地区妇女中的流行情况，优势型别以及优势型别的L1、L2、E6、E7基因变异情况的报道很少。本项目研究了中国西南地区妇女HPV感染的型别、分布规律以及HPV-16、18和58型等主要高危型病毒L1、L2、E6、E7基因的变异情况。另外，通过构建16型、18型、58型HPV E6/E7标准品质粒，我们建立了16型、18型、58型HPV病毒基因拷贝数的绝对定量检测体系，并使用该体系对宫颈癌患者组织中HPV DNA拷贝数进行了绝对定量检测。此项目对研究云南省HPV分子流行病学和预防HPV感染提供了重要的基础数据和理论依据，对于该地区宫颈癌的防治、研制适合该地区的预防性HPV疫苗有重要的参考意义。 研究内容包括： 1、本项目以中国西南地区妇女门诊病人中正常以及炎症细胞人群（ASC-US，即意义不明的不典型鳞状细胞）和宫颈癌患者为研究对象，调查了该区HPV亚型的感染以及分布。对采集获得7146例妇科门诊宫颈脱落细胞样品以及100例宫颈癌标本开展相关的研究。通过提取基因组DNA，以MY09/ MY11 为外引物，GP5+/ GP6+为内引物，采用nest-PCR法对样品HPV-DNA高变区L1区的相应基因进行扩增、测序，与全部130余种HPV型别序列进行全谱分析、比对，确定HPV分型，并对优势型别进行L1、L2、E6、E7基因特异性扩增，测序。获得L1、L2、E6、E7基因序列后用软件Geneious4.8.4进行比对，将获得的新基因序列上传至GenBank获得基因登录号。用软件Mega4.1使用邻接法（Neighbor Joining，NJ），对L1、L2、E6及E7基因完成进化树分析。 应用 PAML4.0 软件内的位点模型分析L1、L2、E6及E7经受正向选择的位点，依卡方分布进行似然比值检验。 2、本项目获得了200多个新基因序列，上传至GenBank并获得了NCBI基因登录号。基因比对和生物信息学分析结果表明，中国西南地区妇女ASC-US人群中HPV的流行高危型主要型别为HPV-16型，HPV-58型，HPV-33型；低危型主要为HPV-6型，HPV-11型。宫颈癌患者中以HPV-16，HPV-18型为主。ASC-US人群易感人群为31岁-40岁妇女，宫颈癌患者的易感人群比上述年龄推后10岁。而且，宫颈鳞状细胞癌患者中，HPV-16型为主要感染亚型。L1/L2基因进化树分析表明，中国西南地区HPV-16及HPV-58主要归类于2-3个分支，多数HPV-58 L1及L2 归类于亚洲及欧洲分支D90400 (Japan)，EU918765，HQ537760。A979C (T327P) 是HPV-16 L1基因最为常见的突变，位于人及鼠主要的B细胞表位。选择压力分析表明HPV-16及HPV-58 L1及L2基因中的绝大多数突变位点均为正选择突变位点。 3、通过对E6/E7基因变异分析发现，中国西南地区妇女中HPV-16型E6基因最常见的突变位点为T178G或T178A，即D25E；E7基因常见突变位点为A647G（N29S）和同义突变点T846C。E6/E7基因序列联合分析发现HPV-16型突变位点E6-D25E与E7- N29S-T846C为连锁突变位点，并且为常见变异型。HPV-58型E6基因最常见的突变位点为K93N，E7基因常见突变位点为同义突变点T744G和非同义突变点T20I，G41R，G63S，G63D和V77A，且突变T20I-G63S和突