Experiment7直接计数法一.前言总菌数测定式计算微生物数量的直接.doc

Experiment 7 直接計數法 前言 總菌數測定式計算微生物數量的直接方法，可分為直接計術法與間接計數法，兩者分別利用不同工具以計算菌體個數，本實驗將以直接計數法(血球計數法)測定之。 目的 熟悉血球計數器之功能及結構以及顯微鏡之操作流程，並從中學習計算菌數，而非觀察菌體。 實驗器材 項目 所需數量 項目 所需數量 光學顯微鏡 1 試管架 1 血球計數器 1 定量玻璃滴管 1 酵母菌(市售) 0.5克 二段水 適量 玻璃試管 1 50ml錐形瓶 1 安全吸球 1 標籤 6 培養液 200ml 100ml燒杯 1 四.血球計數法概述 血球計數器為直接計數法中最常用的方法，計數器上凹槽 有一 邊長1mm的正方形格子，該格內分為25個大方格(5*5)， 每一大方格再細分為16個小方格(4*4)，因此每小方格的邊長為 0.05mm。在高度方面，蓋上蓋玻片後，玻片與計數器的間距恰好 為0.1mm，故每小格的體積等於0.00025mm三次方。實驗時滴入 菌液蓋上蓋玻片(22mm*22mm)，使菌液充滿計數器凹槽中，接著 以顯微鏡觀察計算小方格內菌體數量，即可求得單位體積樣品之 總菌數。 五.實驗步驟 Step1:取0.5克酵母菌粉加於50ml培養液中，搖晃均勻 Step2:將酵母菌進行連續十倍稀釋 1ml 1ml 1ml 1ml …… 待測樣品 9ml培養液 9ml培養液 9ml培養液 9ml培養液 (100) (10-1) (10-2) (10-3) (10-6) Step3:測吸光值 利用UV-vis spectrophotometer 測菌液之吸光值波長調至595mm。 光譜儀內有兩凹槽，先以培養液裝兩個比色管 至八分滿已進行歸零較正。 將外側比色管取出，加入菌液約八分滿，將測其吸光值。(測定順序為低濃度往高濃度測定) 吸光值最好介於2~0.01之間，一旦吸光值與不 同稀釋倍數之吸光值變化量太小時，代表濃度已太高或太低，應捨棄不用。 Step4:以血球計數器算菌數 吸取稀釋好之菌液，滴於血球計數器之中央，再蓋上專用之蓋玻片。 以顯微鏡觀察並計算菌數 Step5:換算成菌液菌數 個菌/cm3 Step6:以吸光值和菌數作圖，求其線性關係 (例:Y=Ax+b 及 R2) 六.實驗計算結果/作圖 稀釋倍數 10^-1 10^-2 10^-3 10^-4 10^-5 座標（1，1） 63 11 2 1 0 座標（1，2） 61 9 1 1 0 座標（1，3） 55 4 1 0 0 座標（1，4） 52 5 0 0 1 座標（1，5） 48 4 0 0 1 座標（2，1） 66 9 1 0 0 座標（2，2） 62 9 2 0 0 座標（2，3） 59 3 2 0 0 座標（2，4） 47 10 0 0 0 座標（2，5） 47 3 0 0 0 座標（3，1） 65 5 1 1 0 座標（3，2） 61 7 1 1 0 座標（3，3） 58 6 0 0 0 座標（3，4） 51 5 0 0 1 座標（3，5） 47 6 1 0 0 座標（4，1） 63 6 1 1 0 座標（4，2） 61 5 1 1 0 座標（4，3） 55 6 1 0 0 座標（4，4） 48 6 0 0 0 座標（4，5） 47 6 0 0 1 座標（5，1） 62 9 1 1 0 座標（5，2） 59 4 0 1 1 座標（5，3） 53 4 1 0 0 座標（5，4） 51 3 0 0 0 座標（5，5） 46 2 0 0 1 大格總計菌數 1387 147 17 8 6 中格平均菌數 55.48 5.88 0.68 0.32 0.24 推回原液菌數 138700000 147000000 170000000 無效值 無效值 吸光值 0.482 0.06 0.007 0.002 0.001 log原液 8.1420765 8.1673173 8.2304489 　 　 標準差= σ 七.問題討論 1.說明以直接計數法(血球計數法)進行微生物計數之原 理與優缺點為何? Ans:優點:方便、快速、節省時間 缺點:無法辨識微生物為死亡或生存狀態，也無