热稳定生物素化荧光素酶制备及其在焦测序中应用.docVIP

热稳定生物素化荧光素酶制备及其在焦测序中应用 　　摘 要 新一代大规模焦测序技术需要稳定的可固定化的荧光素酶，为了制备热稳定性好且被生物素化的荧光素酶，本研究采用基因工程方法将生物素羧基载体蛋白C端87个氨基酸残基（BCCP87）与荧光素酶在大肠杆菌??E. coliBL21(DE3)中进行融合表达，以实现菌体内直接表达生物素化的荧光素酶（BCCP-LUC）；并对北美萤火虫(Photinus pyralis??）荧光素酶基因进行了定点突变以增强其热稳定性；用链亲和素包被的磁珠对重组融合蛋白进行固定化，用于焦测序。实验结果表明: 突变后的荧光素酶在50 ℃环境中仍具有活性；在??43 ℃下10min活性保留大于80%，热稳定性明显增强。Western blot分析结果表明, 荧光素酶能够在大肠杆菌内生物素化。用链亲和素包被的磁珠结合BCCP-LUC后具有较高活性（2.1×10??5RLU/μL Beads），经过多次洗涤活性无明显下降。采用微球固定的荧光素酶以及ATP硫酸化酶成功的进行了DNA序列的测定且定量准确，表明固定化的荧光素酶可以应用于焦测序中，为建立高通量大规模芯片焦测序技术提供有效、稳定的工具酶。 　　 　　关键词 生物素化荧光素酶; 大规模焦测序; 生物素羧基载体蛋白?? 　　 　　1 引 言?? 　　萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase，EC 1.13.12.7）能够在Mg2+??存在的条件下催化以荧光素(Luciferin)、ATP和O 2为底物的生物发光反应[1]。利用该生物发光反应建立了各种生物检测技术，如焦测序技术（Pyrosequencing）[2]。焦测序技术是在DNA 聚合酶（DNA polymerase）、三磷酸腺苷硫酸化酶（ATP sulfurylase）、萤光素酶（Luciferase）和三磷酸腺苷双磷酸酶（Apyrase）的协同作用下，将模板DNA中每掺入一个dNTP产生的PPi转化为光信号，通过检测光信号实时测定模板DNA的序列[3]。目前，焦测序技术广泛应用于基因SNP分析[4]、病毒与细菌的快速检测[5,6]以及基因表达量差异分析 \[7]等。 近年来，高通量光导纤维皮升级微反应池阵列焦测序技术的开发是测序技术史上的一次革命，此技术灵敏度高、测定时间短， 一次可以测定近10亿个碱基序列，能够在数月内完成全人类基因组的序列测定，极大推动了后基因组学研究进程 \[8]。这种测序技术的关键点之一是需要使用能够固定于磁性微球表面且热稳定性好的荧光素酶。?? 　　为了使酶固定在磁珠表面，通常采用化学反应法对酶进行生物素修饰，再利用生物素与链亲和素的特异性结合的特性，将酶固定于链亲和素包被的磁珠表面。但是，化学修饰法特异性较差，易对酶的活性中心造成影响，并且存在操作繁琐、产物不均一的缺点。生物素羧基载体蛋白（Biotin carboxyl ??carrierprotein, BCCP）是大肠杆菌中唯一的生物素受体[9,10]，经生物素连接酶的催化，生物素被共价连接到BCCP的Lys122的??ε??-NH 2上。将它C末端87个氨基酸（BCCP87）与外源蛋白融合表达，从而使大肠杆菌内直接表达生物素化的外源蛋白[11,12]。由于菌体内表达的每个酶分子只含有一个生物素分子，并且酶与生物素分子间有87个氨基酸作为连接子，所以酶在固定后仍具有较高活性。将萤火虫荧光素酶与生物素羧基载体蛋白（BCCP）进行融合表达[13]，实现在菌体内对荧光素酶进行生物素化修饰。但是，这种生物素化的荧光素酶与野生型荧光素酶相似都存在着热稳定性差的缺点，尤其是外界环境温度超过40 ℃时，活性会在短时间内丧失[14]。文献\[15\]报道，对北美萤火虫（Photinus pyralis）荧光素酶相应的位点定点突变后，可使耐热性提高，稳定性增强。但是，将这种耐热突变后的荧光素酶与BCCP融合表达获得热稳定性好且生物素化的荧光素酶未见报道。?? 　　本研究利用基因工程的方法将BCCP87与耐热突变后的北美萤火虫荧光素酶在大肠杆菌内融合表达，实现了生物体内荧光素酶的生物素修饰，获得了稳定性好且可以固定化的荧光素酶，并成功应用于固相焦测序。 　　 　　References?? 　　?A1 Deluca M..Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol.??, 1976, 44: 37~68?いA 　　2 Elahi E, Ronaghi M..Methods Ｍol. Boil??., 2004, 255: 211~219?いA 　　3 Hyman E D..Anal. Biochem.??, 1998, 174(2): 423~436?いA 　　4 ZＨＡ