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用于PCR分析芥菜型油菜总DNA快速提取 　　摘要 通过对所提DNA质量、效率和PCR检测，建立和优化了可用于PCR分析的芥菜型油菜总DNA的提取方法，这一方法快速，所提的DNA质量好，可在芥菜型油菜生长发育早期进行。 　　关键词 芥菜型油菜；快速提取DNA；PCR分析 　　中图分类号 Q523；S565.401文献标识码A文章编号1007-5739（2008）16-0172-02 　　 　　DNA的快速提取是分子标记技术广泛应用的基础。一般植物DNA提取技术大都采用CTAB法、SDS法。本研究在前人的基础上改进了DNA的提取方法，并根据油菜叶子蛋白多、脂类物质含量高、DNA难以提取的特点，选择了成苗时期叶片为材料，摸索可用于PCR分析的DNA快速提取方法，并优化了芥菜型油菜PCR反应体系。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1试验材料 　　芥菜型地方品种为四川黄籽和紫叶芥的自交系。 　　1.2方法 　　提取液配方采用文献法[1]，分别配SDS和CTAB提取液。 　　1.2.1油菜总DNA提取步骤。①在新配DNA提取液中加β-巯基乙醇，每毫升提取液加4μL β-巯基乙醇备用。②取0.5g幼嫩叶片，加液氮，研磨成粉末状。迅速加入2mL上述提取液，轻轻摇动研钵，使材料在提取液中分散均匀。③静置10min，用剪口的1mL吸头吸取600μL上清液匀速加入已编号的1.5mL灭菌eppendorf管中，每材料取2管（其中紫叶芥加适量的活性炭，吸附色素）。④加入等体积的氯仿-异戊醇混合液（氯仿∶异戊醇=24∶1）充分摇匀，63℃水浴25min。⑤取出离心管迅速置于-20℃冰箱冷却3～5min，12 000rpm离心5min。⑥小心取出离心管，用剪口的0.2mL吸头吸取上清液300μL，合并2管上清液。⑦加入等体积的氯仿-异戊醇，充分混匀，12 000rpm离心4min。⑧用剪口的0.2mL吸头吸取上清液400μL转入1.5mL离心管中，加入3mol/L NaAC使其终浓度至0.3M（每100μL上清液加11.11 μL 3mol/L NaAC），混匀。⑨加入2倍体积冰冷无水乙醇（预先在-20℃冷藏），温和倒转数次，置于-20℃冰箱中15min（使DNA充分沉淀析出）。⑩倾斜离心管，用干净枪头带出絮状沉淀，转入加有0.5mL 70%乙醇的新灭菌离心管中，5 000 rpm离心3min。{11}倒去上清液，再加0.5mL 70%乙醇洗1次。再倒去上清液，瞬时离心，用20μL吸头吸干残留液体后，离心管置于超净工作台上吹干。{12}将粗提DNA溶在200μL TE（10mmol/L Tris-Cl∶1mmol/L EDTA）溶液中。{13}加入等体积的氯仿-异戊醇混匀，12 000rpm离心5min。{14}转移上清液150μL，加入2倍体积冰冷无水乙醇，混匀，置-20℃冰箱20min。{15}10 000rpm离心3min，倒去上清液，用70%乙醇洗涤2～3次。{16}瞬时离心，用20μL吸取残留液体，置于超净工作台上吹干。{17}用灭菌超纯水或TE（10mmol/L Tris-Cl∶0.1mmol/L EDTA）100μL溶解DNA。{18}用核酸蛋白质分析仪检测浓度，并结合琼脂糖凝胶电泳检测质量，后置于-70℃冰箱长期保存。 　　1.2.2特异引物PCR。引物1的上游引物为GTCAGAAAG AGACCGTNTGYGTNAC、下游引物为TTCCATTCACTG TCGGYTTDAT；引物2的上游引物为CATCTTGGCTAT TGGNACNGC、下游引物为CTTGACGGAAGGACGNAR NCC[2]；由上海生物工程技术服务有限公司合成。反应体系和扩增程序参照《靶向新基因分子克隆策策略》的方法进行优化[3]。反应体系总体积为25μL，反应体系各成分见表1。 　　引物1反应扩增程序为（T-gradient PCR热循环仪）：94℃预变性3min；93℃变性50s；55℃退火50s；72℃延长100s，循环39次，72℃延长5min。引物2反应扩增程序为：94℃预变性3min；93℃变性50s；57℃退火50s；72℃延长100s，循环39次，72℃延长5min。 　　1.2.3随机引物PCR。随机引物、Taq酶、dNTP、10X Buffer、 Mg2+购自上海生物工程技术服务有限公司，反应体系总体积为25μL，反应体系各成分见表1。 　　94℃预变性3min；93℃变性50s；36.5℃退火50s；72℃延长100s，循环39次，72℃延长5min。 　　1.2.4电泳检测。所提取的总DNA通过0.8%的琼脂糖凝胶（100mL中含10mg/mL EtBr溶液5μL）电泳检测质量。电泳1h左右，在凝