用于无创产前诊断SRY基因高灵敏高特异检测方法研究.docVIP

用于无创产前诊断SRY基因高灵敏高特异检测方法研究 　　]摘 要 通过检测母体外周血中胎儿游离DNA（cffDNA）的SRY基因，确定胎儿性别，可评估胎儿性连锁遗传病的发病风险，降低病儿出生率。本研究建立了高灵敏、高特异、闭管检测不易污染的实时荧光PCR偶联核酸侵入反应方法用于SRY基因的检测。通过优化反应体系中的检测探针浓度、FEN1酶用量、Taq酶用量及预扩增退火温度，确定了最佳的反应条件，即检测探针浓度为250 nmol/L、FEN1酶用量为7.5 U、Taq酶用量为0.5 U、预扩增退火温度为67℃。在最佳反应条件下， 实现对含量低至4‰ （4 copies/μL）的模拟样本的检测，并成功检测两例孕期分别为9周和10周的临床实际样本。结果表明， 所建立的方法可用于母体外周血cffDNA的SRY基因检测，为临床开展基于SRY基因的无创产前诊断提供了新方法。 　　1 引 言 　　我国是人口大国，约4%的新生儿受到一种或多种先天性疾病的影响，而在所有的先天性疾病中，大约35%为遗传性疾病[1]。产前诊断可在胎儿出生前了解胎儿的发育状态，及时进行干预治疗。传统的产期诊断方法有羊膜腔穿刺、绒毛活检等，它们是目前临床产前诊断的“金标准”，虽然可以给出大多数染色体疾病的明确结果，但伴随着宫内感染和约0.2%～0.5%的胎儿流产风险[2， 3]。无创性产前诊断（Noninvasive prenatal diagnosis， NIPD）是指利用母体外周血中胎儿成分或是胎儿特异性标志物进行的遗传学分析或诊断[4]，这些胎儿成分或特异性标志物包括胎儿有核红细胞、胎儿游离DNA（Cellfree fetal DNA， cffDNA）等。1989年，Lo等[5]发现孕妇外周血中存在胎儿有核红细胞，但Price等[6]估计母体外周血中胎儿有核红细胞含量很低，富集获取困难，并且在产后几年内长期存在于母血中，使其临床应用受到限制。1997年，Lo等[7]首次报道了母体外周血中存在cffDNA； 随后，又通过实时荧光PCR方法测得孕妇血浆中cffDNA占血浆总DNA的3.4%～6.2%，含量远高于孕妇外周血中胎儿细胞DNA[8]。接着，从血浆中提取cffDNA的有效性和稳定性得到证实[9]。此外，cffDNA具有诸多适合产前诊断的特点，如半衰期短、清除快； 不受母?w之前妊娠干扰[10]； 可进行实时动态监测； 可从长度上与母体游离DNA进行区分。cffDNA作为理想的产前诊断胎儿成分，已成为NIPD领域的研究热点。 　　SRY基因是位于Y染色体短臂上的男性性别决定基因，人的SRY基因只含有1个外显子，没有内含子，转录单位长度约1.1 kb，编码一个含有204个氨基酸的蛋白质[11]。以SRY基因为检测靶标，通过对cffDNA的SRY基因检测确定胎儿性别，可评估如甲型血友病[12]、杜式肌营养不良等性连锁遗传病的发病风险，降低病儿的出生率[13]。 　　常见的SRY基因检测方法有普通PCR[7]，灵敏度低、容易污染； 巢式PCR[14]，虽然灵敏度和特异性有所提高，但仍需开管电泳分析； 最普遍使用的方法是实时荧光PCR[8， 15]，灵敏度高、不易污染但需较贵的Taqman探针。为此，本研究建立一种基于实时荧光PCR偶联核酸侵入反应的SRY基因检测方法，将基于PCR的模板扩增与基于核酸侵入反应的信号放大技术相结合，具有高灵敏、高特异、低成本、闭管检测不易污染等优点。最终实现对含量低至4‰ （4 copies/μL）的模拟样本的检测，并成功检测两例孕期分别为9周和10周的临床实际样本。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　RotorGene Q实时荧光定量PCR仪（德国Qiagen公司）； Allegra X30冷冻离心机（美国Beckman Coulter公司）； Wizard Genomic DNA Purification Kit（美国Promega公司）； QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（德国Qiagen公司）； FEN1核酸内切酶（实验室自表达[16，17]）； Taq 酶（美国Promega公司）； 3（N吗啉基）丙磺酸（MOPS， 美国Amresco公司）； MgCl2（美国NEB公司）； dNTP（上海赛百盛公司）； 其它试剂均为分析纯； 实验用水均为灭菌双蒸水。 　　2.2 样本收集与处理 　　孕妇EDTA抗凝血样本由南京军区南京总医院提供，取4 mL新鲜外周血以7400 r/min离心10 min， 小心吸取上层血浆置于干净离心管中， 13000 r/min再离心10 min得到血浆样本，按照QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit的