农学第十章园艺植物遗传转化1.ppt

第一节 园艺植物遗传转化受体系统 (5)对农杆菌侵染的敏感性 1）农杆菌介导的 遗传转化体系需要受体材料是农杆菌的天然寄主，否则难以实现遗传转化 2）农杆菌Ti或Ri质粒是植物遗传转化的有效载体系统，但其宿主范围局限于部分双子叶植物，对大部分单子叶植物和裸子植物不敏感，不同植物，同一植物的不同组织细胞对农杆菌的敏感性也有很大差 因而，在选择农杆菌转化系统前必须测试受体系统对农杆菌的敏感性，只有农杆菌侵染敏感的植物才能作为受体系统 第四节 提高外源基因在园艺植物体内表达水平的策略 （七）使用基质结合区序列 基质结合区（MAR）又称核骨架结合序列（SAR），是存在于真核细胞染色质中的一段与核基质特异性结合的DNA序列，大小为300～2000bp，富含AT和保守结构区域。 研究发现，MAR是一种新的顺式作用元件，将其置于所转基因的两侧，构建成MAR-gene-MAR，可以创造一个独立的结构域。这样可克服基因组对外来基因的识别和抑制，并阻隔了周围染色质顺式调控元件的影响，减少位置效应，显著提高转基因的表达水平。 第四节 提高外源基因在园艺植物体内表达水平的策略 （八）防止甲基化 DNA甲基化现象广泛存在与动植物细胞中，它影响DNA的许多重要的生物学功能，包括DNA复制起始、突变、限制修饰系统、基因表达调控及组织分化等。 研究表明，在高等植物DNA中约30%的胞嘧啶核苷酸被甲基化，DNA甲基化具有抑制基因表达的作用，活化的基因往往处于未甲基化状态，通过改变DNA甲基化状态可以调控基因的表达。 第二节 园艺植物遗传转化方法 2.基本步骤及其应用 基本程序包括： 1）外源DNA的制备； 2）根据受体植物受精过程及时间，确定导入外源DNA的时间及方法； 3）将外源DNA导入受体植物； 4）转基因植物目标性状的鉴定及分子检测。 利用花粉管通道法导入外源基因的方法通常为： 花粉粒与外源DNA混合授粉法、花粉粒培养法、柱头滴柱法、花粉粒转化法和微注射法等。 第二节 园艺植物遗传转化方法 3.优缺点 优点： 1）不依赖于细胞、原生质体等组织培养和诱导再生植株等过程，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握，成本低，适宜普及； 2）适用于多种单、双子叶植物 局限性： 1）该种方法只能在开花期才能进行，而且受体植物的受精过程及时间规律难以掌握； 2）重复性差、成株转化率相对低，以及外源DNA整合机制不清楚的问题依然存在 第二节 园艺植物遗传转化方法 （三）种子浸泡转化法 定义：浸泡转化法指将供试外植体如种子、胚、胚珠、子房、幼穗甚至幼苗等直接浸泡在外源DNA溶液中，利用渗透作用可将外源基因导入受体细胞并得到整合与表达的一种转化方法。 第二节 园艺植物遗传转化方法 1.转化原理 浸泡转化是利用细胞自身的物质运转系统将外源DNA直接导入受体细胞。 将外源DNA吸入植物细胞的途径有： 1）通过细胞间隙与胞间连丝组成的网络化运输系统可以将外源DNA运输到每个细胞； 2）通过内吞作用将外源DNA摄入细胞内； 3）通过传递细胞的膜透性的改变为大分子物质透过细胞提供机会 第二节 园艺植物遗传转化方法 2.基本步骤及其应用 浸泡转化法的基本步骤： 1）外源DNA的制备； 2）具有生活能力种子的获得及浸泡处理； 3）在浸泡液中加入外源DNA； 4）种子培养、发芽及抗性鉴定。 第二节 园艺植物遗传转化方法 3.优缺点 优点：种子浸泡转化法是植物转基因技术中最简单、快捷、便宜的一种转化方法，不需要昂贵的仪器设备和复杂的组织培养技术，可以进行大批量的受体转化工作，并且容易推广普及； 局限性：在于转化率低，重复性差，而且筛选和检测也比较困难。 第三节 园艺植物转化植株的鉴定 为了筛选和鉴定携带目的基因并稳定表达的转化植株，已发展处一系列的转化基因植物的筛选和鉴定的方法： 1）根据检测的基因功能分为： 调控基因（启动子和终止子）、选择表及基因检测、 目的基因直接检测法 2）根据检测的不同阶段分为： 整合水平检测、表达水平检测法 第三节 园艺植物转化植株的鉴定 3）外源基因整合检测方法为： Southern杂交、PCR、PCR-Southern杂交、原位杂交、DNA分子标记技术等 4）表达水平的检测方法为： Nourthern杂交、RT-PCR、酶联免疫吸收法（ELISA）、Western较等 第三节 园艺植物转化植株的鉴定 一、利用选择标记基因和报告基因鉴定 定义： 选择标记基因是指在选择压下，编码产物能够使转化细胞、组织具有对抗生素或除草剂的抗性，而非转化细胞则不能在施用选择剂的条件下生长、发育和分化的基因。选用选择标记基因有利