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第八章 生物大分子制备技术 1 第一节 概 述 ? 生物大分子主要是指蛋白质、酶和核酸 ? 蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功 能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生 物大分子结构与功能的研究，必须首先解决 生物大分子的制备问题。 2 与化学产品的分离制备相比较， 生物大分子的制备有以下主要特点： 1.生物材料的组成极其复杂; 2.许多生物大分子在生物材料中的含量微小; 3.许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境就极易 失活.(分离过程中如何防止其失活? 难题) 4.实验结果常有很大的经验成份，实验的重复性较 差。 3 生物大分子的制备通常可按以下步骤进行： ①确定要制备的生物大分子的目的和要求。 ②建立可靠的分析测定方法 ③掌握生物大分子目的产物的理化性质。 ④生物材料的预处理和细胞破碎。 ⑤分离纯化方案的选择。 ⑥生物大分子制备物的均一性（纯度）的鉴定。 ⑦产物的浓缩，干燥和保存。 4 制备生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要 是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形 状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他 分子的亲和性等。 目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电 泳、层析、高(超)速离心。 5 制备的要求 1.纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。 如为研究蛋白的结构，要求均一； 工业医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即 可，不要求均一。 2.活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的 生物活性。 3.收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中 总有不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。 6 第二节 材料的选择与预处理 一、材料的选择 1.主要根据实验目的而定。 工业生产上注意选择含量高、来源丰富、制备 工艺简单、成本低的动植物组织或微生物做原料。 科研选材则无需考虑上述问题，只要能达到实 验目的即可。 7 2. 实验材料选定后，常需要进行预处理 如动物材料需要除去一些与实验无关的结缔组 织、脂肪组织；植物种子需要除壳；微生物需要将 菌体与发酵液分开。 另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工 处理。若不立即进行实验或加工，应冷冻保存。 8 二、 细胞的破碎及细胞器的分离 ? 分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分 子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出 来，并保持原来的天然状态，不失生物活性。 因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎。 ? 但若材料是体液（如血）或生物体分泌到体外 的分泌物，则不必进行组织细胞的破碎。 9 组织细胞的破碎方法 p130 ? 不同的实验材料使用不同的破碎方法。 ?动物组织和细胞：可用电动捣碎机或匀浆器 破碎或用超声波处理破碎。 ?植物组织和细胞：由于具有细胞壁，一般常 用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法 破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。 10 ?细菌细胞的破碎：比较困难，因为整个细菌细胞 壁的骨架是共价键连接而成的肽聚糖大分子，非常 坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研 磨、高压挤压、溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。 ?反复冻融法 ?自溶法 ?溶胀法 ?有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶 性溶剂 ?表面活性剂处理细胞:SDS等 11 细胞器的分离 ? 各类生物大分子在细胞内分布是不同的，要根据 目的物质的位置来选择材料（细胞器）。 ? 如果要分离制备分布在细胞器中的生物大分子， 为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰 或污染，还需先将细胞器分离出来，然后在某一 细胞器中分离某一物质。 13 14?细胞器的分离一般采用差速离心法，即将破碎后的 细胞在适当的介质中进行离心。 14 线粒体 第三节 生物大分子的提取与纯化 生物大分子：蛋白质、核酸、糖类、脂类等 提取：组织细胞破碎后，大量的细胞内含物被释 放出来，将其置于一定条件下和溶剂中，让制 备物充分溶解。 固相→液相 15 一、生物大分子的提取 以蛋白质为例 （一）水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、 是提取蛋白质最常用的溶剂。 1. 温度：一般采用低温（5度以下）操作。 2. 为了避免蛋白质降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙 基氟磷酸，碘乙酸等）。 3. 提取液的pH值和盐浓度。 提取液的pH值应选择在偏离等电点的pH 范围， 通常采用类似生理条件下的缓冲液，如20-50m mol/L的磷酸 盐缓冲液（pH7.0-7.5）或0.1mol/L Tris-HCl（pH7.5-8.0） 缓冲液作提取液。 16 （二）有机溶剂提取法 提取脂蛋白、脂溶性大分子 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较 多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀 碱，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取，它们具 有一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂 蛋白的提取液。必须