【生物课件】第七章 色谱技术 [Chapter 7 Chromatography].pptVIP

Expanded Bed 分子筛凝胶色谱 在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经体积的不同，使不同相对分子量的组分得以分离 优点： 操作简便 分离效果好，重复性高，回收率高 分离条件温和 应用广泛 适用于生物大分子的初级分离，脱盐 分辨率低 分子筛凝胶色谱原理 Desalting proteins proteins salts 疏水作用层析(Hydrophobic Interaction Chromatography） Hydrophobic interaction chromatography is a liquid chromatography technique that separates biomolecules according to their hydrophobicity Mechanism of HIC A 280 0.04 AU Na2SO4 1.0 M 疏水层析操作 凝胶色谱填料 葡聚糖凝胶 Sephadex G-系列 聚丙烯酰胺凝胶 Sephacryl系列 琼脂糖凝胶 Sepharose系列 Superose系列 亲和色谱（Affinity chromatography） 载体活化、配基连接、吸附、洗脱 Competitive elution 蛋白质分离常用的色谱方法 免疫亲和层析 属于吸附色谱中的一种，利用抗原-抗体作用的高度专一性以及较强的吸附力，实现特殊蛋白质的分离 免疫亲和层析介质的获得： （1）获得抗体 （2）抗体连接到载体上 疏水层析 在载体表面连接上疏水的直链碳链或其他疏水基团，如苯基，可以与蛋白质的某些疏水基团相互作用，从而实现多组分的分离。 操作要点 蛋白质的局部变性 洗脱采用逐步降低盐浓度的方法进行 离子交换色谱是最常用的蛋白质分离手段 操作要点： 由于蛋白质是两性电解质，在不同的pH值下，其解离程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也可以用阴离子交换，可视具体情况而定 由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗脱困难，通常采用弱阳或弱阴离子交换剂 适当调节缓冲溶液的pH值，使蛋白质适当解离，通常采用的pH值靠近其等电点（不是等电点） 缓冲溶液的离子强度不能过高，通常在10~20m mol 层析方案的确定，需要视试验情况作适当调整 洗脱方式：pH梯度 离子强度梯度 AIEX Technique Ultrafiltration UF Superdex 200 p.g. GF Purificationfactor Q Sepharose FF 10 times purification 82% yield Phenyl Sepharose HP HIC Y.-F. Liao et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 28348 63 622 719 Purification of recombinant a-mannosidase from Pichia pastoris ?KTA explorer 100色谱系统 ?KTA explorer 100色谱系统工作流程 纸层析 是一种常用的快速分离、鉴定方法，可用于定性分析以及确定分离方案，但一般不用于定量分析 介质：滤纸 操作方法：将试样溶于适当溶剂中，点样于滤纸的一端；选用适当的展开剂，借助毛细管现象从点样的一端向另一端流动，展开结束后，取下滤纸，晾干，染色显迹 展开剂的选择 展开剂可以是单一溶剂，也可以是混合溶剂 常用的氨基酸纸层析体系中使用的展开剂为：正丁醇-甲酸-水（15：3：2） 展开方式： 上行色谱 下行色谱 径向色谱 薄层色谱法 将固定相涂布在惰性固体上，形成薄层进行色谱分离的方法 常用的固定相有： 硅胶和氧化铝 优点： 设备简单、操作方便 快速 显色方式多，如可以选用浓硫酸等进行显色 灵敏度高（较纸层析） 可以大量制备 多肽的分离纯化 蛋白的纯化 Technique Ppt HIC AIEX CIEX AC Purificationfactor 7 20 2408 18647 Porcine cerebella homogenate RESOURCE Q Ammonium sulfateprecipitation Butyl Sepharose Fast Flow RESOURCE s HiTrap Heparin G Protein Receptor Kinase Purification Rec a-Mannosidase Purification from Pichia Technique Purificationfactor 63 622 719 UF GF AIEX H