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石榴种质资源遗传多样性及亲缘关系ISSR分析 　　摘要：利用ISSR标记技术对47个石榴品种遗传关系进行了分析。筛选出多态性高的6条ISSR引物，共扩增出120条DNA条带，其中多态性带109条，多态性百分率为90，83％，有效等位基因数(Ne)、Nei’s基因多样(H)、Shan-non信息指数(I)分别为1.2945±0.3094、0.1897±0.1618、0.3091±0.2198，遗传距离(Dg)变异为0.0750～0.4000，表明石榴品种间存在比较丰富的遗传多样性。利用UPGMA法构建分子树状图，将47个石榴品种分为5个类群。同时检测到15条特异性条带，可用于供试石榴中的11个品种鉴定的参考性标记。 　　关键词：石榴；ISSR；种质资源；遗传多样性；亲缘关系 　　中图分类号：$665.4　文献标识码：A　文章编号：1009-9980(2011)01-66-06 　　 　　石榴(Puntca granaturn L.)为石榴科石榴属落叶灌木或小乔木，又名若榴、丹若、天浆、金罂、狂花等。石榴原产伊朗、阿富汗等中亚一带，从西汉张骞出使西域将涂林安石榴引入我国，至今已有超过2000a的栽培历史，经长期天然杂交及基因突变。以及采用实生、分株、嫁接等多种繁殖方法，使其产生了复杂多样的品种和类型，据不完全统计，我国现有石榴品种资源约200多个，分布南北各地20多个省区。各地研究者对石榴种质资源进行调查研究时，大多都局限于某一地区，各自从不同的角度对石榴进行了种下分类，导致品种混杂、同种异名、同名异种的现象出现，长期以来，给准确进行品种资源鉴定和利用带来了困难。我们究旨在利用ISSR标记技术，对石榴的遗传多样性与亲缘关系进行分析，以期为石榴种下分类提供分子依据，为更有效地保护石榴资源及选育新品种提供遗传信息。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1.1　材料 　　供试的47个石榴品种资源(表1)采自云南蒙自县石榴研究所石榴品种资源圃、四川会理县农业局石榴品种资源圃及新疆、河南零星采集，采集后用冰壶运回，于-70℃冰箱保存。 　　 　　1.2　DNA提取 　　采用改良CTAB法从石榴幼叶中提取总DNA，具体操作参见赵丽华等的方法，并稍加改进：CTAB裂解液加入0.015mol?L-1硼酸，65℃水浴延长至1h。0.8％(w／v)的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，并用biospee-mini DNA／RNA／protein核酸蛋白分析仪测定DNA含量，放人-20℃冰箱保存。工作液稀释到50mg?L-1，放入4℃冰箱里备用。 　　 　　1.3　引物筛选及PCR扩增 　　由上海英骏生物技术有限公司根据加拿大哥伦比亚大学(Univer sity of British Columbia，UBC)公布的第9套引物序列合成100条ISSR引物，筛选出DNA条带清晰、多态性较高的引物，用MastercyclerGradient PCR仪(Eppendoff)筛选出引物的最适退火温度，对47个石榴品种基因组DNA进行ISSR-PCR扩增，最后进行数据统计分析。优化确定25μL的PCR反应体系含有的组分和终浓度为：Mg2+1.75mm01.L-1、dNTPs 0.15 mmol?L-1、Taq DNA聚合酶1U、模板DNA 40ng、引物0.6 mmol?L-1及1×PCRbuffer。扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，退火(温度表2)1min，72℃延伸2min，40个循环：72℃延伸10min。立刻进行电泳。 　　 　　1.4　扩增产物检测及数据统计分析 　　ISSR-PCR产物采用2％琼脂糖凝胶(含100IxL.L-1 Goldview核酸染料)分离扩增产物，电压为2V.cm-1，电泳2h，用复日FR-200A全自动紫外与可见分析装置观察并拍照记录。 　　将保存的电泳图谱采用Cross Checker-2.91版软件结合人工计数对各引物扩增图像进行条带统计，每一条带(DNA片段)为一个分子标记，代表引物的一个结合位点，根据各DNA片段的迁移率及其有无进行统计，对清晰的带(包括强带和清晰可辨的弱带)，在相同迁移位置上有带记录为1，无带记录为0，统计各引物的多态性位点，建立由“0、1”组成的二元数据矩阵数据库。采用PopGen32软件在假定Hardy-Weinberg Disequilibrurr条件下，计算等位基因数(Na:Observed number of alleles)、有效等位基因数(Ne:Effective number ofalleles(Kimura andCrow(1964)、Nei’s基因多样性(H：Nei’s(1973)gene diversity)、Shannon信