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石榴果皮DHQSDH基因克隆及序列分析 　　摘要：以泰山红石榴果实为试验材料，利用逆转录PCR（RT-PCR）技术扩增出980 bp大小的中间片段，用 3′cDNA 末端快速扩增PCR（RACE PCR）获得DHQ/SDH基因的3′端，拼接后获得1 585 bp的cDNA片段。结果表明，该基因含有1 265 bp编码序列（CDS），编码421个氨基酸，其氨基酸序列与苹果（注册号：XP_008370537.1）、葡萄（注册号：XP_002270232.1）、白梨（注册号：XP_009335660.1）的同源性分别为82%、84%、82%；蛋白质理论分子质量为 133 682.2 u，等?点为5.01，含量最丰富的氨基酸是丙氨酸（Ala）、半胱氨酸（Cys）、甘氨酸（Gly）、苏氨酸（Thr），具有DHQase I、SDH（AroE）2个保守结构域，为亲水性蛋白；二级结构主要由无规则卷曲（31.12%）、α-螺旋（30.17%）、伸展链（24.94%）和β-转角（13.78%）组成；GenBank登录号为KU133479。 　　关键词：石榴；DHQ/SDH基因；克隆；序列分析 　　中图分类号： S665.401；Q785 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0026-04 　　石榴（Punica granatum L.）是一种重要的功能性水果，富含类黄酮、酚酸和鞣花单宁等可溶性酚类物质，市场发展前景广阔[1]。没食子酸是石榴果实中重要的酚类物质，具有抗肿瘤[2]、抗氧化[3]、抗炎抗菌[4-5]等诸多功效，生物学效应广泛[6]。莽草酸途径在植物次生代谢途径中起到中心作用，可为其他次生代谢途径提供底物。研究表明，没食子酸主要通过莽草酸途径生成的3-脱氢莽草酸代谢生成[7-8]。 　　脱氢奎尼酸脱氢酶（3-dehydroquinate dehydratase，简称DHQ）、莽草酸脱氢酶（shikimate dehydrogenase，简称SDH）分别催化莽草酸途径中的第3、第4步反应，在大多数微生物中，DHQ、SDH是单功能的，但是在植物中，DHQ、SDH可以融合，形成具有2种功能的酶[9]。3-脱氢奎尼酸脱氢酶（EC4.2.1.10）/莽草酸脱氢酶（EC1.1.1.25）双功能酶（bifunctional 3-dehydroquinate dehydratase/shikimate dehydrogenase，简称DHQ/SDH）能催化3-脱氢奎尼酸脱水生成3-脱氢莽草酸，也能催化3-脱氢莽草酸、莽草酸之间的可逆还原反应，是没食子酸代谢途径中的关键调控酶[10]。编码SDH结构基因aroE的克隆、表达分析和功能鉴定在结核杆菌[11-12]、谷氨酸棒杆菌[13]中已有报道。DHQ/SDH基因cDNA的片段或全长序列已在豌豆[14]、烟草[15]、番茄[16]等植物中被克隆出来，通过全基因组测序推测苹果、葡萄、白梨、桃等果树DHD/SDH基因的片段或全长已在GenBank上注册，但是关于石榴中DHQ/SDH基因的克隆及序列分析等方面的研究在国内外尚未见报道。因此，本研究以山东省主栽石榴品种泰山红为试验材料，利用逆转录PCR（RT-PCR）技术克隆DHQ/SDH基因，对其进行生物信息学分析，从而为揭示石榴果实中没食子酸代谢的分子机制提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　试验于2015年6―9月在山东省果树研究所进行。以泰山红石榴果实为试验材料，将其定植于山东省果树研究所石榴种质资源圃。于幼果期（果实直径2～3 cm）采集石榴果实，洗净擦干后，用削皮刀取果皮，在液氮中速冻后放入 -80 ℃ 冰箱保存备用。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 总RNA提取和cDNA第1链的合成 采用RNA Prep Pure Plant Kit[DP441，天根生化科技（北京）有限公司]提取石榴果皮的总RNA，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，用NanoDrop紫外分光光度计测量吸光度，计算RNA纯度，即D260 nm/D280 nm值。 　　以RNA溶液为模板，Oligo（dT）18为引物，根据cDNA第1链合成试剂盒说明书反转录成cDNA第1链（K1622，Thermo Scientific）。 　　1.2.2 基因中间片段的克隆 根据已知物种同源序列的保守片段设计兼并引物，进行PCR扩增。预计扩增片段大小为1 000 bp，上游引物DHQ/SDH 1：5′-GCVATGGAGYTVGGRGCTGATT-3′；下游引物DHQ/SDH 2：5′-GTTGTRTTBGCRAGDAYCATVCC-3′。50 μL PCR反应体系：25 μL 2×Ex Taq buffer，1 μ