Hi-C三维基因组学研究利器（一）.PDFVIP

Hi-C ：三维基因组学研究利器 （一） Hi-C 发展历史 DNA 在染色体上是高度折叠的，DNA 与 DNA 片段之间不可避免的形成了高强度的交互作用， 对基因的表达、远端调控等起重要作用。2002 年 Dekker 等[1]提出利用 3C 技术研究染色体的 三维构象，该技术基于 PCR 原理，针对特定位点设计上下游引物，用于研究单个点和点之间的 相互作用；在此基础上发展起来的 4C 技术[2] ，将DNA 片段连接成环，然后设计引物进行反向 PCR ，可以研究一个点和多个点之间的相互作用；5C 技术[3]进一步发展，在 DNA 片段两端加 上通用引物，进而实现多个点和多个点之间的相互作用；3C、4C 和 5C 技术都是基于 PCR 技 术发展而来，不能用于研究全基因组范围内所有点之间的相互作用。2009 年 Lieberman-Aiden[4]等提出的 Hi-C 技术，在片段两端加上生物素标记，再利用磁珠对其捕获， 进而实现全基因组范围内所有点之间的相互作用的研究，Hi-C 技术的出现，将三维基因组学的 研究向前推进一大步。 图 1 Hi-C 发展历史[5] Hi-C 实验流程 2009 年发表在 science[4]的 Hi-C 技术称为第一代 Dilution Hi-C ，该文章对Hi-C 实验流程进 行了详细叙述，主要步骤包括甲醛交联、细胞裂解、内切酶酶切、末端修复及生物素标记、片 段连接、捕获带生物素标记的片段、双端测序等。2011 年 Chen Lin 等[6]意识到细胞核的扰动 会影响染色质的高级构象，故而将反应体系固定在磁珠上，减小反应体系的扰动，大大提高了 信噪比。2014 年发表在 Cell[7]上的文章进一步对 Hi-C 实验流程进行改进，将 DNA-DNA 的连 接反应在完整的细胞核中进行，而并非在早期裂解细胞，将该方法定义 In situ Hi-C ，有效数据 较 Dilution Hi-C 获得较大提升。文库构建是 Hi-C 技术的重难点，文库质量将直接影响后续的 有效 Hi-C 数据，因此进一步加强对实验流程的优化仍将是后续 Hi-C 研究的重点。 图 2 Hi-C 实验流程[7] Hi-C 数据处理 Hi-C 文库测序基于二代测序平台，首先，对 Raw Data进行过滤，去除接头序列及低质量 Reads ， [8] [9] 获得高质量的 Clean Data ；其次利用BWA 或者 HiC-Pro （调用bowtie2 ）将双端Clean Data 与组装好的基因组序列进行比对，获得唯一比对到基因组上的 Reads ；然后使用HiC-Pro 或者 HiCUP[10]软件分析比对结果，识别 Valid Interaction Pairs 和 Invalid Interaction Pairs ，其 中，Invalid Interaction Pairs 主要主要包含自连类型（Self-circle Ligation ），末端悬挂类型 （Dangling Ends ）、相邻连接类型（Re-ligation ）和其他丢弃的类型（Dumped ），Valid Interaction Pairs 数据在 30%以上即认为数据合格，可用于后续研究。 图 3 Hi-C 数据处理[9] Hi-C 研究内容 细胞核内的染色体都是高度折叠的，不同物种的折叠方式各不相同，包括 Rabl、Bouquet 和 Rosette 结构。染色体长度较长的物种倾向于采用 Rabl 结构（如大麦[11] ），该结构每条染色体 向后折叠使长臂和短臂并列，着丝粒和端粒分别聚集在细胞核两级，而染色体长度较短的物种 则倾向于采用 Rosette 结构（如拟南芥[12] ），该结构中心是高度折叠的着丝粒区域及大的重复 序列，周围是常染色质环结构。我们通过 Hi-C 对高度折叠的染色体进行研究，用于辅助基因组 组装、解析染色质空间构象和构建染色体单倍型图谱等。 图 4 细胞内染色体折叠方式[13] 辅助基因组组装 细胞核内每条染色体都占据着一个独特区域，称为染色体疆域，同一染色体上的交互频率高于 不同染色体间的交互频率，从而实现将初步组装的 Contigs 分配到