斑马鱼抗氧化基因gsr与gstm的表达模式及功能研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所 取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包 含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所 涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名： 温焕焕 2015 年 5 月 20 日 ┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄┄ 非公开学位论文标注说明 (本页表中填写内容须打印) 根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申 请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本 说明为空白。 论文题目 申请密级 □限制(≤2 年) □秘密(≤10 年) □机密(≤20 年) 保密期限 20 年 月 日至 20 年 月 日 审批表编号 批准日期 20 年 月 日 南开大学学位评定委员会办公室盖章(有效) 注：限制★2 年(可少于 2 年);秘密★10 年(可少于 10 年);机密★20 年(可少于 20 年) 摘 摘 要 摘 要 斑马鱼是新型的脊椎模式生物，因其众多的生物学优势，以及与哺乳动物 相似的基因组学、细胞学以及生理学特征，被广泛应用于脊椎动物发育生物学 以及毒理学等多个领域的研究中。本研究利用基因突变和转基因等分子生物学 技术构建斑马鱼模型以进行抗氧化基因谷胱甘肽还原酶 gsr 与谷胱甘肽巯基转 移酶 gstm 的功能及表达模式的研究。gsr 与 gstm 基因是与谷胱甘肽代谢密切相 关的酶，GSH 是机体细胞内含量最丰富的非蛋白类小分子，并且是抵御氧化压 力损伤的第一道防线。GSR 在 NADPH 的辅助下催化氧化型 GSSG 还原成 GSH， 继续发挥其抗氧化功能。GSTM 是 GST 超家族中的一员，以 GSH 为底物，将外 源氧化物催化为对机体危害小的产物，从而起到解毒作用。 本研究使用 CRISPR/Cas9 系统构建斑马鱼 gsr 与 gstm 基因突变模型，该系 统是现代基因工程中强有力的基因改造的工具，具有高效性和灵活性。体外构 建的用于突变的含有突变靶点序列的 gRNA 与 Cas9 核酸内切酶的 mRNA 一起， 通过显微注射技术注入到斑马鱼单细胞受精卵中，从而获得靶点序列突变的斑 马鱼突变模型。Gateway 重组技术和 Tol2 转座技术联合应用，快速并且高效的 构建出斑马鱼 gsr 与 gstm 转基因模型。用于转基因的含有目的基因启动子的 gateway 重组质粒与 Tol2 转座酶的 mRNA 一起，通过显微注射技术注入到斑马 鱼单细胞受精卵中，从而获得能特异表达 EGFP 报告基因的斑马鱼转基因模型。 为进一步确定这两个基因的表达模式，我们制作了目的基因的 RNA 探针，完成 了斑马鱼胚胎不同发育时期的整体原位杂交实验。 本研究成功构建的转基因斑马鱼模型的绿色荧光蛋白特异性表达结果与斑 马鱼胚胎不同发育阶段的整体原位杂交实验结果共同确定了 gsr 基因与 gstm 基 因的表达模式。同时，gsr/gstm 转基因模型完成了氧化还原压力的测试，gsr 基 因与 gstm 基因的表达会随着外界氧化环境的变化而变化，当外界氧化压力增大 时，抗氧化基因 gsr 与 gstm 增强表达，以抵御外界氧化压力对机体造成的损伤。 因此，本研究为抗氧化药物的筛选工作提供了可用的转基因斑马鱼模型。 关键字：转基因；基因突变；CRISPR/Cas9；Gateway；原位杂交 I Abst Abstract Abstract The zebrafish has emerged as a powerful model organism for the study of vertebrate biology. There are several biological advantages of zebrafish , and it shares many genetic, cellular, and physiological characteristics with mammals and it’s widely used as models in many studies including vertebrate developmental biology and toxicology. In this study, we created zebrafish models to study the expression patterns and functions of antioxidant gen