斑马鱼牙齿再生模型的构建及其初步研究-口腔医学专业论文.docxVIP

重庆医科 重庆医科大学硕士研究生学位论文 万方数据 万方数据 英汉缩略语名词对照 英文缩写 英文全称 中文全称 Amp Ampicillin 氨苄 bp Base pair 碱基对 BSA Bovine serum albumin 牛血清白蛋白 cDNA Complementary deoxynucleic acid 互补脱氧核糖核酸 DMSO Dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜 DNA Deoxynucleic acid 脱氧核糖核酸 dpf Day post fertiliaztion 受精后天数 EP Eppendorf 离心管 hpf Hour post fertiliaztion 受精后小时数 LB Luria-Bertani 液体培养基 mM millimolarity 毫摩尔 Mtz Metronidazole 甲硝哒唑 NTR nitroreductase 硝基还原酶 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链反应 pK PTU Proteinase K propylthiouracil 蛋白酶 K 丙基硫尿嘧啶 RNA Ribonucleic acid 核糖核酸 rpm Revolutions per minute 转速/分 1 斑马鱼牙齿再生模型的构建及其初步研究 摘要 牙齿是消化系统的重要组成部分，此外还兼顾发音和美观功能。 牙齿缺失是先天或后天因素导致的牙齿发育障碍或脱落，该疾病虽不 致命但会严重影响人们的生活质量。除了乳恒牙替换阶段，一旦牙齿 缺失将无法自行修复再生。传统的修复方式虽然能恢复部分牙齿形态 和功能，但是和天然牙齿相比仍存在着较大的差距。近些年来随着人 们对牙齿的自我保健意识的增强， “第三副牙齿”已成为人们殷切的期 盼。牙齿再生因重要的医学价值而成为研究的热点。 目前，牙齿发育及再生的首选模式动物多局限于小鼠等哺乳动物， 近年的研究使我们对牙齿的早期发育、组织分化及器官的构建有一定 程度的了解。然而哺乳类模式生物有着自身的局限性，其胚胎发育和 分化过程中所涉及的调控机制难以获得深入研究。斑马鱼具有深入探 究机体发育调控分子机制的独特优势，是研究牙齿发育和再生的新兴 模式生物。 特异性损伤模型主要基于 Mtz/NTR 系统。通过构建重组转基因系， 使细胞特异性表达硝基还原酶（NTR）。Mtz/NTR 系统特异性损伤的 原理是特异性表达 NTR 的组织在甲硝哒唑（Mtz）作用下，NTR 被 NADH 或 NADPH 还原后与 Mtz 结合，将无毒性的 Mtz 转化为有细胞 毒性的代谢物，从而特异性导致表达 NTR 的细胞死亡。 目的 构建斑马鱼器官模型，利用 Mtz/NTR 系统造成牙胚特异性 损伤，观测损伤后有无再生现象，为后期前体细胞的定位追踪提供条 件。 2 方法 本实验首先构建 pBluescriptⅡ-dlx2b-Dendra2-NTR 重组质 粒将斑马鱼牙胚的特异性启动子 dlx2b 连接到 Dendra2-NTR 的上游， 从而使牙胚细胞能够特异性表达细菌的硝基还原酶（NTR）并呈现绿 色荧光。运用显微注射技术向单细胞期的斑马鱼胚胎动物极内注射重 组质粒，重组质粒将随机整合到斑马鱼基因组内，经数代繁育筛选获 得能够稳定遗传的 dlx2b:Dendra2-NTR 转基因斑马鱼系。利用 Mtz/NTR 系统对其造成牙胚特异性损伤。 结果 本实验成功构建了斑马鱼牙胚特异性定位损伤模型。选用 72hpf-96hpf 时期的 dlx2b：Dendra2-NTR 转基因斑马鱼作为 Mtz 作用起 始时间点，经验证用 12mM Mtz 处理 24 小时后，相比对照组，实验组 的胚胎牙胚荧光明显减弱，继续处理达 48 小时后，运用激光共聚焦显 微镜未发现残存牙胚细胞。撤去 Mtz，经过 48 小时的恢复可看到明显 的牙齿再生现象。 结论 实验证明所建立的 dlx2b: Dendra2 NTR 转基因斑马鱼系能 够特异性损伤牙胚，撤除药物后损伤的牙胚能够再生。可用于牙齿再 生过程中细胞来源的定位追踪和相关分子机理机制的探索。 关键词：斑马鱼，牙齿，损伤修复，Mtz/NTR 系统，转基因系 Tg(dlx2b:Dendra2-NTR) 3 GENERATION AND PRELIMINARY STUDY OF ZEBRAFISH TOOTH REGENERATION MODEL ABSTRACT Except for pronunciation and beautiful function tooth is an important part of the digestive system. Missing teeth may not affect li