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芒果C4H基因克隆及其表达分析 　　摘要：肉桂酸-4-羟基化酶（C4H）是植物苯丙烷合成途径的关键酶之一，其蛋白质活性和转录丰度直接影响植物中黄酮类化合物和芳香族化合物的生物合成量。根据已经报道的C4H基因的序列设计兼并引物，采用3′RACE、5′RACE方法，克隆得到芒果果实C4H基因的全长cDNA序列为1 680 bp。该基因开放阅读框为1 518 bp，编码505个氨基酸，分子量为58.08 ku。蛋白等电点为9.52，分析发现该基因主要定位在线粒体中。通过软件预测得到3种三级蛋白结构图；通过系统发育分析发现，该基因编码的蛋白与橄榄、可可等植物具有较近的亲缘关系。对不同着色的芒果品种的C4H基因表达进行分析发现，红色的贵妃品种中表达量最高，而绿色的桂七品种中表达量最低。 　　关键词：芒果； C4H基因；克隆；蛋白质；生物信息 　　中图分类号： S667.701文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）14-0008-04 　　肉桂酸-4-羟化酶（cinnamate-4-hydroxylase，简称C4H），别称反式肉桂酸-4-单氧化酶，是细胞色素单加氧酶P450超家族的成员之一[1]，该酶由Russell等首次从豌豆芽中发现[2]，它是苯丙素类化合物生物合成途径里继苯丙氨酸脱氨酶（phenylalanineammonia-iyase，简称PAL）之后的第2个关键调节酶，其作用是将苯丙氨酸途径的合成酶复合物固定在内质网上[3]；同时，在氧和磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，简称NADP）存在下，将反式肉桂酸苯环的4位羟基化生成对-香豆酸[4]。C4H分布在微粒体中，能够原位利用PAL催化产生的苯乙烯酸。普遍认为，肉桂酸-4-羟化酶是苯丙素类物质代谢中一??调节点[2]。由于肉桂酸-4-羟化酶基因在植物次生代谢中有这些重要的作用，因此被广泛关注。自上世纪80年代以来，肉桂酸-4-羟化酶的基因克隆逐渐成为一个研究热点。迄今，已有拟南芥、大豆、花生、杜仲等50多种植物的C4H基因被分离出来[5-10]。与苯丙氨酸脱氨酶基因类似，肉桂酸-4-羟化酶基因的拷贝数在不同植物之间存在差异。如：苜蓿C4H基因有2个拷贝，豌豆的C4H基因只有1个拷贝，绿豆和长春花的C4H基因家族都有多个成员。这些不同植物种的C4H基因所编码的氨基酸序列相似性极高，同源性普遍在85%左右。但玉米和法国菜豆中的2个C4H酶蛋白氨基酸序列例外，同源性只有60%[11]。C4H基因在植物各组织中均具有很高的活性[11-14]，研究表明，C4H的蛋白质活性和转录丰度直接影响植物中黄酮类化合物、木质素、芳香族类化合物的合成等多条代谢途径[15-16]。芒果是重要的热带、亚热带果树，果实色彩多样，有绿色、黄色、浅黄色、红色、橙红色等。芒果果实富含类胡萝卜素、花色素苷等物质，其中花色素苷合成途径是红色芒果果实着色的一个主要的代谢途径。芒果果实C4H基因的研究工作未见报道，本研究采用cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，简称RACE）从芒果的果实中克隆得到1个C4H基因，深入探讨该基因在芒果果实花色素苷合成的作用机制及其对果实着色的影响，借以深入揭示该基因在芒果果实花色素苷生物合成的分子机制，以期为芒果果实着色研究提供一定理论依据。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　试验所用芒果（品种有红色贵妃、黄色金煌、绿色桂七）果实取自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所的农业部芒果种质资源圃。引物委托上海英俊生物工程技术服务有限公司合成，其他药品如：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，简称为IPTG）、酵母抽提物（yeast extract，简称YE）、氨苄青霉素（ampicillin，简称为Amp）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷（简称为X-GaL）、pMD-19T载体及各种酶均购自宝生物工程（大连）有限公司。 　　1.2试验方法 　　1.2.1芒果总RNA提取采用天根生化科技（北京）有限公司生产的总RNA提取试剂盒用RNase-free无菌水溶解，并用宝生物工程（大连）有限公司的DNase试剂盒进行DNA去除，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性和DNA是否去除干净。 　　1.2.2PCR反应程序94 ℃预变性4 min；95 ℃变性50 s，50 ℃复性50 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；最后72 ℃延伸 7 min； 反应体系为25 μL，其中含10×PCR buffer（含Mg2+）2.5 μL、25 n