研究LncRNA一种新方法---RNAscope技术.PDFVIP

研究LncRNA 的一种新方法RNAscope 技术 我们对RNA 的理解在过去几十年里不断得到发展，RNA 不仅仅只承担遗 传信息中间载体的辅助性角色，而是更多地承担了各种调控功能。ncRNA 在发 育和基因表达中发挥的复杂精确的调控功能极大地解释了基因组复杂性之难题。 对ncRNA 的研究主要的手段是对细胞或组织提取的RNA 进行定量和定性 的分析，常用的方法包括定量PCR，芯片，测序，northern blot 等。为了获得 ncRNA 在细胞及组织中的表达信息，对细胞或组织直接进行RNA 检测也是非常 必要的，这就需要用到原位杂交的方法。原位杂交的方法可以提供目标RNA 在 单个细胞内的空间定位，以及 合组织形态学显示在组织中不同类型细胞表达 RNA 的精确信息。传统RNA 原位杂交选择放射性标记、荧光标记或生物素标记 的RNA 探针，存在特异性差、灵敏性差的缺点，因此在ncRNA 研究中的应用受 到了很多的限制。 RNAscope 是基于独特的探针设计和信号放大方法的原位杂交方法。它采用 类似于荧光共振能量转移(FRET) 的探针设计策略, 两个独立的探针( 双Z 探针) 必须串联杂交到目标序列才能引起信号放大发生， 合在非特异性位点的单个 Z 探针不会产生一个完整的信号放大分子 合位点，从而防止非特异性信号的放 大，显著提高了检测的特异性（见图1）。每个RNA 分子只需三对双Z RNA 探针 合到目标RNA 就可以检测到信号，该方法的高灵敏性使RNAscope 平台具有 原位检测人类转录组中大多数基因的能力，很多低丰度的RNA 也可以清晰的显 示空间位置。RNAscope 双Z 探针的设计方法要求检测的RAN 长度要求至少 300 碱基以上，因此，这个方法已经被广泛用于长链非编码RNA （LncRNAs）的研 究。 目前LncRNA 在肿瘤、干细胞、发育等领域的研究都非常火热。以干细胞为 例，探讨一下RNAscope 技术在LnRNA 研究中的应用。目前研究已经发现了数 十种功能性的lncRNA，在干细胞命运决定，x 染色体沉默、基因印记、剂量补偿 效应、调控蛋白活性、RNA 剪切等生命活动中发挥着极广泛的调控作用，并参与 到一些重要疾病的发生发展过程中。在LnRNA 的机制研究中，首先我们需要确 定LnRNA 在细胞内的定位，以初步预测LnRNA 的可能功能。要进行细胞定位， 一种方法是通过细胞核和细胞浆的RNA 提取和定量分析，初步推断LnRNA 在 细胞内的分布。接下来就该RNAscope 上场了。原位杂交清晰显示LnRNA 的细 胞定位及定量情况，为LnRNA 的细胞定位提供了最为直接的证据。在细胞水平 LnRNA 机制研究 束后，就到了体内验证的阶段了。LnRNA 没有蛋白产物，因 此要在体内检测LnRNA 的表达情况，高灵敏度高特异性的RNAscope 原位杂交 的方法就是最佳选择了。下面以加州大学洛杉矶分校再生医学和干细胞伊莱和 伊迪特-布罗德中心(Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research at UCLA)Lim DA 团队最新在cell stem cell 上发表的文章，为 我们实例演示一下RNAscope 在LnRNA 研究中的应用。为了研究长 链非编码RNA Pnky 在神经干细胞的神经元分化中的调节作用，利用RNAscope 技术，非常清晰的显示长链非编码RNA Pnky 在培养的神经干细胞主要表达在细 胞核中。进一步体内小鼠脑切片中应用RNAscope 原位杂交技术显示Pnky 主要 在冠状脑区特异性表达。这为下一步研究Pnky 对神经干细胞分化调节提供了重 要的线索。 A B 图2 The lncRNA Pinky Is Expressed in V-SVZ NSCs and Regulates Neuronal Differentiation。 有关RNAscope 应用于研究LncRNA 的文章已经在近两年不断发表，我们 总 了这些文章的研究内容，并在ACD 网站上