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花生ABI3基因克隆序列分析及表达载体构建 　　摘要：脱落酸（ABA）作为植物体内的一种重要激素，参与植物多个生长发育过程。ABI3是ABA信号转导途径中的关键基因。本研究采用RT-PCR技术从花生成熟种子中克隆到ABI3的同源基因AhABI3。预测该基因开放阅读框为2313 bp，编码770个氨基酸。同源比较发现AhABI3与拟南芥、鹰嘴豆等的ABI3具有较高的相似性；进化分析表明AhABI3与鹰嘴豆ABI3亲缘关系最近。本研究还成功构建了AhABI3的过量表达载体pCambia2300EC-AhABI3，为进一步研究其功能奠定了基础。 　　关键词：花生；AhABI3；进化树分析；氨基酸比对；植物表达载体构建 　　中图分类号：S565.201 　　文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）02-0001-06 　　花生（Arachis hypogaea L.）是一种豆科植物，其种植面积排在稻谷、小麦、玉米、大豆、油菜和甘薯之后，列第七位，在油料作物中，其种植面积仅次于油菜。花生作为我国重要的油料和经济作物，在油料生产和国际贸易中占有举足轻重的地位，与油菜、芝麻、向日葵等油料作物相比，花生的单产、总产量和出口量均居首位。 　　脱落酸（ABA）作为植物体内的一种重要激素，参与植物多个生长发育过程，如抑制种子萌发、促进休眠、抑制生长、促进叶片衰老脱落等。ABI3基因是ABA信号转导途径中的关键基因，在调节种子成熟、萌发等生长过程中起着重要作用。 　　拟南芥ABI3在种子成熟过程中起着主要调节作用。玉米VP1基因与拟南芥ABI3基因在氨基酸序列水平上有较高的相似性，它能使种子早熟，抑制胚胎和糊粉层中花青素积累。ABI3/VP1的同源基因也已在其他植物中发现，如水稻、菜豆、燕麦、胡萝卜、白杨等，这些基因编码的蛋白序列的高度保守性表明该转录因子家族在调控开花植物的胚成熟过程中发挥着极其重要的作用。Giraudat等对ABI3和VP1蛋白序列的分析发现了3个高度保守区域，从氨基端分别命名为B1、B2和B3。从玉米VPI中分离出其B3结构域，发现它在体外可以与C1基因启动子上的Sph基序（含有RY元件）特异性地结合。郭晓芳等通过Northern杂交技术检测到ABI3同源基因在花生种子的子叶和胚中表达，但是没有对该基因进行克隆。 　　本研究从花生“X-166”成熟种子中克隆到AB13的同源基因AhABI3，经同源比对和进化树分析，AhABI3与来自其它物种的ABI3有较高的同源性；构建了AhABI3的过量表达载体pCam-bia2300EC-AhABI3，旨在研究该基因在花生中的作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 植物材料及载体 　　试验所用“X-166”花生种子由山东省花生研究所提供；植物表达载体pCambia2300EC（添加了35S启动子以及Tnos终止子的pCambia2300载体）由山东农业大学元宝秀教授馈赠。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 AhAB13基因序列的获得及PCR扩增 利用拟南芥ABI3 mRNA序列（GenBank登录号：NC_003074.8）在花生基因组数据库（http：//）中进行BLAST，获得可能的花生AhABI3序列（PU48P.1）。根据预测基因的开放阅读框（ORF），用DNAClub设计引物F1、R1（表1）。 　　提取花生种子总RNA，用ReverAid FirstStrand cDNA Svnthesis Kit（Fermentas）试剂盒进行反转录获得单链cDNA，利用引物F1、R1对该基因的开放阅读框进行扩增。PCR反应体系：5×HF Buffer 10 μL， dNTP Mix（10 mmol/L）2μL，引物F1 2μL，引物R1 2μL，DMS0 0.6μL，高保真酶Phusion（New England Labs）0.2μL，模板1μL，ddH2O32.2μL。PCR反应程序：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸1min，循环30次；72℃后延伸10min。用1%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后，切取含目的条带的凝胶，用琼脂糖凝胶回收试剂盒（北京天根生化科技有限公司）回收PCR产物。将回收产物与pEASY-Blunt simple载体（北京全式金）连接、热激法转化大肠杆菌DH5a（北京全式金），取阳性克隆送上海桑尼生物科技有限公司测序，将测序正确的克隆命名为pEASY-AhABI3-1。 　　1.2.2 AhABI3基因序列和氨基酸序列分析 基因开放阅读框、氨基酸序列比对由DNAMAN序列分析软件（Lvnnon Biosoft）完成。 　　1.2.3 系统发育树的构建将AhABI3编码的氨基酸序列与来