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花生内转录间隔区扩增及序列分析 　　摘要设计1对特异引物,以花生栽培种四粒红及其与野生种光叶花生的种间杂种为材料,对花生ITS1-5.8S-ITS2序列进行高保真PCR扩增,获得长度约800bp的单一条带,在对PCR产物进行克隆测序的基础上构建了花生属进化树。 　　关键词花生;内转录间隔区(ITS)序列;PCR;进化树 　　中图分类号Q789文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)08-0103-02 　　 　　内转录间隔区序列(ITS)广泛应用于被子植物系统进化研究,为禾本科、大豆属、棉属等植物的系统进化研究提供了宝贵的分子遗传学依据。花生rDNA有关研究报道较少,尽管有分离 rDNA ITS的报道,但未在此基础上进行花生属植物的系统发育分析。本研究对花生ITS序列进行分离、测序,并将其与GenBank中登录的花生ITS序列进行比较和分析,为花生的系统演化及花生的分类鉴定提供分子水平的证据。 　　 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　试验所用花生为栽培种四粒红(Silihong)及四粒红与野生种光叶花生的杂交后代(Silihong×Arachis glabrata Benth.)高世代材料。花生种子取自山东省花生研究所莱西试验站。 　　根据Bhagwat等报道的ITS序列,使用软件DNAS-TAR.Lasergene.v7.1设计1对特异引物: 　　ITS12-1∶5’-GTCGATGCCGCACAAACCAGGATT-3’ 　　ITS12-2∶5’-CGGGCACAACGGGGCTCTCA-3’ 　　这对引物的扩增区包含ITS1、5.8S和ITS2完整区域。引物由上海英俊生物技术有限公司合成。 　　1.2方法 　　取3~5粒花生未成熟的叶片置于1.5mL离心管中,加40μL 0.25mol/L NaOH,用1mL枪头套一PCR管将叶片捣碎,煮沸30s,加160μL含PVP-40的Tris-HCl(pH值7.6),煮沸2min,10 000rpm离心5min,取上清液4℃保存,用时取1μL作模板。取1-1D4-1、1-4D4-1、四粒红各品种未成熟叶片按上述步骤作简单处理,依次编号为1、2、3作为PCR模板。 　　PCR程序为:94℃ 5min,(94℃ 1min,52.1℃ 1min,72℃ 1.5min)30个循环,72℃ 10min。先用Takara Taq DNA聚合酶作PCR,确定有预期分子量大小的条带后再用高保真Pfu DNA聚合酶扩增,切胶回收DNA,连接转化后挑取阳性克隆测序。利用DNASTAR.Lasergene.v7.1进行多序列比对。 　　用Mega4.0软件以拟南芥核rDNA序列为外群组(outgroup),采用3种方法(NJ、ME、MP)构建进化树,并进行bootstrap analysis 1 000检验[2]。 　　 　　2结果与分析 　　2.1ITS区序列的PCR扩增 　　以总DNA为模版,利用所设计的 2条引物PCR扩增出ITS区的特异性条带,分子量在800bp左右(图1),与GenBank所登录的ITS序列片段长度相近。用Taq DNA Pol PCR体系和pfu DNA Pol PCR体系所扩增出的ITS区序列片段电泳迁移率相同。 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　2.2ITS1-5.8S-ITS2序列测定与多序列比对 　　四粒红与野生种光叶杂交后代扩增产物6份穿刺培养物测序得到3条有差异的条带,分别命名为1-1、1-2、1-4。四粒红扩增产物测序后得到的序列命名为3-3。 　　通过比对发现4条序列在ITS1-5.8S-ITS2区共有单核苷酸多态性位点14个,其中6个位于ITS1区,2个位于5.8S rDNA中,6个位于ITS2区,其他植物上的研究认为5.8S rDNA在进化上相当保守,而ITS1和ITS2则变化很大,本试验结果与这一结论一致。 　　2.3花生属进化树构建 　　通过NJ、ME和MP法构建花生属进化树,其拓扑结构大致相似,但也有所区别。总体看来,各个区组的材料分别聚集到一起,与基于传统形态学特征的花生属区组划分基本一致。从本研究所构建的3棵进化树来看,围脉(Ex)区组、三籽粒(Tris)区组、大根(C)区组在花生属中是比较原始的,花生区组(A)进化程度较高;Gregory等根据花生属种间可交配性提出围脉(Ex)区组、直立(Er)区组和根茎(R)区组原根茎系较原始,而花生(A)区组、三籽粒(Tris)区组、大根(C)区组、异形花(H)区组、匍匐(P)区组以及根茎(R)区组真根茎系进化程度较高。 　　研究结果表明