西伯利亚蝗基因组DNA提取及RAPD分析条件优化.docVIP

西伯利亚蝗基因组DNA提取及RAPD分析条件优化 　　摘　要　以西伯利亚蝗Gomphocerus sibiricus(L.)为研究材料，利用改良的SDS法提取高质量的DNA，分别测试了dNTP浓度、镁离子浓度、Taq DNA聚合酶用量、模板DNA的量等因素对反应结果的影响。通过各因子的组合比较，建立了西伯利亚蝗RAPD优化体系：25μLPCR反应体系，1O×buffer2.5μL；dNTP0.24mmol/L；MgCl22.0 mmoI/L；TaqDNA聚合酶1U；DNA模板45ng；引物30ng。扩增程序为：94℃预变性1min45s、94℃变性30s、35℃退火1min30s、72℃延伸2min，45个循环、72℃延伸10min。结果表明，利用优化的反应条件进行西伯利亚蝗基因组DNA分析，实验有着良好的重复性和稳定性。 　　关键词　随机扩增多态性DNA，基因组DNA，西伯利亚蝗，巴里坤地区 　　 　　RAPD(random amplified polymorphic DNA)技术即随机扩增多态性DNA，是1990年由Williams和Welsh同时发展起来的一种DNA分子水平上的多态性检测技术，能揭示个体间的差异和物种间的相关性。目前，RAPD技术已在昆虫学研究领域中得到广泛应用，其主要用于亲缘关系、遗传多样性以及系统进化方面的研究。 　　西伯利亚蝗Gomphocerus sibiricus(L.)是新疆草原的主要危害种，其广泛分布于北疆沿天山一带。已有报道对西伯利亚蝗的生物学特性方面的研究，但其遗传多样性方面还未见报道。运用RAPD技术对西伯利亚蝗进行遗传多样性分析时，首先要建立稳定的反应体系。为此，本实验就西伯利亚蝗RAPD反应中的dNTP浓度，镁离子浓度，Taq DNA聚合酶用量，模板DNA的量等因素对实验结果的影响进行了摸索，建立了重复性好，稳定的西伯利亚蝗RAPD反应体系，为进一步探讨西伯利亚蝗的遗传多样性以及种间亲缘关系奠定基础。 　　 　　1　材料与方法 　　 　　1．1　材料来源 　　供试的西伯利亚蝗样品采自新疆哈密地区的巴里坤草原(91°19′30″～94°48′30″E，43°21′～45°5′19″N)。将野外采集的蝗虫个体饥饿24h以上，使其消化道?任镏逝趴眨?双蒸水冲洗干净后浸入无水乙醇中浸泡14h，置换无水乙醇，4℃冰箱保存 　　 　　1．2　试剂与仪器 　　所用的蛋白酶K，RNase A，100 bp DNALadder RAPD-PCR扩增试剂盒利RAPD随机引物购自上海生物工程有限公司，其它药品与试利为国产AB级。 　　所用PCR扩增仪为Master Cycler Gradient型梯度PCR仪，离心机为Biofuge fieseo型台式高速冷冻离心机，凝胶成像仪型号为GelDoe2000型。 　　 　　1．3　基因组DNA提取和检测 　　采用SDS法，参照文献并做部分改进、 　　三蒸水浸泡标本48h以上，取蝗虫后足股节剪碎装于2mL的EP管中，加入0.8mL-20℃顶冷的TE(10mmol/L Tris-Cl，1mol/1.EDTA，pH8.0)，研磨成匀浆状，加入0.1mL的5％的SDS和0.1mL的2mg/mL的蛋白酶K，37℃水浴消化过夜；加入RNA酶继续消化1h再分别用等体积的酚，氯仿：异戊醇(24:1)抽提，8000r/min，10min离心分层，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r/min，离心10min，70％的冷乙醇洗涤，自然风干，用TE缓冲液溶解(-20℃保存备用)。 　　用紫外分光光度计检测基因组DNA的浓度和纯度。选取质量好的DNA，将其稀释至15ng/μL。 　　 　　1．4　RAPD反应条件的优化 　　参照张迎春等的反应条件，采用25μL的反应体系，对影响反应体系的各因素设置不同的梯度水平：模板DNA的量分别设置为15，30，37.5，45，60ng；Mg2+浓度为1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mmol/L；Taq DNA酶的浓度为0.5，1，1.5，2.0U；dNTP的浓度为0.08，0.12，0.16，0.2，0.24，0.32Mmol/L；当进行某一因素水平实验时，仅相应调整灭菌双蒸水的量以保证总反应体系为25μL，其它条件与所参照反应体系保持一致。分析各因素对RAPD－PCR结果的影响，从而筛选出最适的反应体系。在此基础上，对反应程序中的退火温度进行优化，确定最适的循环条件。本实验以西伯利亚蝗基因组DNA为模板，以S3为引物(序列5’-CTACTGCGCT-3’)，进行反应条件的优化。 　　 　　1．5　RAPD扩增产物鉴定 　　PCR扩增产物在0.8％琼脂糖凝