背角无齿蚌两个抗菌肽基因的克隆及表达分析-动物遗传育种与繁殖专业论文.docxVIP

上海海洋大学硕士学位论文 万方数据 上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名工作单位职称备注王群华东师范大学教授主席李家乐上海海洋大学教授委员邱高峰上海海洋大学教授委员牛东红上海海洋大学副教授秘书答辩地点水产与生命学院 C217答辩日期2014.05.21 背角无齿蚌两个抗菌肽基因的克隆 及表达分析 摘 要 以背角无齿蚌（Anodonta woodiana）为研究材料，根据本实验室已获得的 theromacin 基因的 cDNA 全 序列 ， 利用 RACE 法克隆得到 背角无齿蚌两个 抗 菌 肽 基 因 （theromacin、mytimacin）的 cDNA 序列，并对这两个基因的 cDNA 序列及推测得到 的氨基酸序列特征进行分析。利用自己克隆得到的背角无齿蚌 β-肌动蛋白（β-actin）基 因作为内参基因，RealTime-PCR 分别检测这 2 个基因在背角无齿蚌血液、肝脏、外套 膜、鳃、斧足和 肠 6 个组织 中的表达 差异 性 ， 并通 过 嗜 水气 单 胞 菌（ Aeromonas hydrophilia）感染，研究这两个基因在背角无齿蚌受到感染后血液、肝脏、外套膜、鳃、 斧足和肠等 6 个组织的不同时间点的表达情况。主要研究结果如下： 1. 背角无齿蚌 theromacin 基因的克隆及表达分析 该 cDNA 序列全长为 870bp，5端非翻译区 104bp，3端非翻译区 460bp，开放阅读 框（ORF）长为 306bp，共编码 101 个氨基酸，包含一段由 27 个氨基酸组成的信号肽和 74 个氨基酸的成熟肽，分子量为 11 166.9U。氨基酸序列分析表明，该序列存在明显的 疏水区，但不存在跨膜结构。同源性分析显示，该基因编码的蛋白与三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）theromacin 氨基酸序列的相似度最高为 73%，而与贻贝等中发现的抗菌肽 defensins、mytilins、myticins 和 mytimycins 等 4 种类型相似度较低。将所得的氨基酸序 列与其他物种的不同抗菌肽的氨基酸序列进行多重序列比对，并构建系统树，结果显示， 本实验克隆所得背角无齿蚌 theromacin 基因与已发表的几种无脊椎动物抗菌肽相聚，而 不与两种贻贝的抗菌肽聚集在一起，推测此基因可能与这两种贻贝中发现的抗菌肽不属 于同一种类型。 在健康背角无齿蚌的血液、肝脏、外套膜、鳃、斧足和肠等 6 个组织中，利用实 时荧光定量 PCR 技术检测 theromacin 基因在这 6 个组织中的表达情况，结果显示外 套膜中的表达量最高，在血液、肝脏和鳃中表达量则较低。 在背角无齿蚌闭壳肌注射灭活的嗜水气单胞菌条件下，于感染后 2h、4h、6h、12h、 24h、48h和 72h等 7 个时间点检测 theromacin 基因在血液、肝脏、外套膜、鳃、斧足 和肠等 6 个组织中的表达情况。结果显示 6 个组织中均有表达，且总体上均出现了先 上调后下降的趋势。 I  2. 背角无齿蚌 mytimacin 基因的克隆及表达分析 该 cDNA 序列获得的部分片段长 466bp，其中开放阅读框长 261bp，编码 86 个氨基 酸，包含一段由 24 个氨基酸组成的信号肽，62 个氨基酸组成的成熟肽，分子量为 9 550.0U。 氨基酸序列分析表明，该序列存在跨膜结构，也存在疏水区。将所得的氨基酸序列与其 他物种的不同抗菌肽的氨基酸序列进行多重序列比对，并构建系统树，结果显示，本实 验克隆所得背角无齿蚌 mytimacin 基因与已发表的几种 Macin 家族抗菌肽聚在一起。 在健康背角无齿蚌的血液、肝脏、外套膜、鳃、斧足和肠等 6 个组织中，利用实 时荧光定量 PCR 技术检测 mytimacin 基因在这 6 个组织中的表达情况，结果显示外 套膜中的表达量最高，在血液、肝脏和鳃中表达量则较低。 在背角无齿蚌闭壳肌注射灭活的嗜水气单胞菌条件下，于感染后 2h、4h、6h、12h、 24h、48h 和 72h 等 7 个时间点检测 mytimacin 基因在血液、肝脏、外套膜、鳃、斧 足和肠等 6 个组织中的表达情况。结果显示 6 个组织中均有表达，且总体上皆出现了 先上调后下降的趋势。 3. 背角无齿蚌 β-actin 基因的克隆及表达分析 该 cDNA 序列全长为 1 392bp，其中 66bp 的 5端非翻译区(UTR)，195bp 的 3端非 翻译区(UTR)，开放阅读框长为 1 131bp，编码 376 个氨基酸，包含一段由 29 个氨基酸 组成的信号肽，74 个氨基酸组成的