声波刺激对拟南芥基因表达影H向.PDFVIP

2005年11月 重庆大学学报(自然科学版) NOV．20O5 第28卷第11期 Journal of Chongqing University(Natural Science Edition) V01．28 No．11 文章编号：1000—582X(2005)11—0138—04 声波刺激对拟南芥基因表达的影H向 王伯初，张 进，段 传 人，王道 红 (重庆大学生物工程学院生物力学与组织工程教育部重点实验室，重庆 400030) 摘 要：运用银染mRNA逆转录差异显示(DDRT—PCR)技术，初步研究了声波刺激对拟南芥差异 基因表达的影响．研究分离得到SA3、SG2—1、SG2—2、SG7—1、SG7—2、CA2共6个差异表达基因片段， 进一步运用Northern点杂交确定SA3、CA2、SG7—1为阳性片段，其中SA3片段属于声波刺激特异表达 基因，SG7—1片段属于声波刺激增强表达基因，CA2片段属于声波刺激抑制表达基因．研究结果表明 植物在基因水平对声波刺激具有响应，为下一步探索植物响应声波应力的分子生物学调控机理奠定了 基础． 关键词：声波刺激；拟南芥；差异显示 中图分类号：Q68 文献标识码：A 由Liang等¨ 于1992年首次建立的mRNA差异 组中加入1．26 g RNA样品，然后加入锚定引物，锚 显示聚合酶链式反应技术 (mRNA differential display 定引物和样品的总体积达到l1 ，不足l1 L时加 PCR，DD—PCR)是目前在筛选、克隆差异表达基因方 入DEPC处理水补足．于70℃育温混合物5 min，在冰上 面广为应用的技术．该方法通常采用测序胶放射自显 冷却，加入：4 ，5×逆转录缓冲液；2 ，10 mmol／L 4× 影来显示扩增条带，虽然有敏感性高的优点，但是易造 dNTP；20 mmol／(rain·L)，RNase抑制剂；加DEPC水 成放射性同位素污染，且实验周期长，对实验条件要求 定容至19 L．在37 oC育温5 rain，加1 L，2．0× 也较高 j．银染方法的建立，始于1979年对蛋白质的 10 mol／(min· )的MMuLV逆转录酶，混合后在 染色【3j，以后逐渐应用于核酸．在笔者的研究中，采用 42℃育温60 rain，加热至7O℃并维持10 rain停止反 银染mRNA差示显示分析了声波刺激后的拟南芥，并 应，然后于冰上冷却． 获得了3个阳性片段． 1．2．3 PCR 在PCR扩增中所选用的锚定引物和逆转录中的 1材料与方法 锚定引物相同，随机引物设计为：HAP1，AAGCTFGAT- 1．1 材料 11GCC；HAP2，AAGCTTCGACT( ；HAP3，AA( TIT— 将拟南芥分为声波刺激组和对照组，声波刺激的 GGTCGA；HAP4，AAGCTICTCAACG；HAP5，AAGCT_ 声强为100 dB，频率为1 000 Hz．对刺激组刺激9 d，每 TAGTAGGC； HAP6， AAGCTrCGACCAT； HAP／， 天刺激60 rain，实验组接受刺激时，对照组也拿出培养 AAGCTIAACGAGG；HAP8．AAGCTITrACCGC． 箱，放置在与实验组条件一致的环境中． 按照每个锚定引物和8个随机引物配对，每个样 1．2 方法 品用3个锚定引物，则共有24个引物对．在PCR扩增 1．2．1 总RNA的提取