第1章节-蛋白质结构与功能.ppt

* * * * * * * * * A convenient method to quantify proteins. * A convenient method to quantify proteins. * 丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 是常用的蛋白质沉淀方法 使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。 盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 盐析原理：盐离子亲水性比蛋白质强，高浓度盐夺去了保护蛋白质胶体的水化膜；同时，盐又是强电解质，能抑制弱电解质的蛋白质解离，从而使保护蛋白质胶体的电荷减少。 盐析时溶液的pH越接近蛋白质的pI，效果越好 。 分段盐析法 将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。 免疫沉淀法（immunoprecipitation） 利用电荷性质可将蛋白质采用电泳法进行分离 蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。 根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。 电泳 E·Q 6πrη V= SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:常用于蛋白质分子量的测定。 等电聚焦电泳:通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。 双向凝胶电泳:蛋白质组学研究的重要技术。 几种重要的蛋白质电泳： SDS电泳 应用相分配或亲和原理可将蛋白质进行层析分离 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。 层析(chromatography) 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。 蛋白质分离常用的层析方法 层析 凝胶过滤层析（分子筛层析） 离子交换层析 亲和层析 利用蛋白质颗粒沉降行为不同可进行超速离心分离 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。 蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。 因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。 超速离心 把肽链水解成片段，分别进行分析 测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法 一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。 测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基 §4.7 多肽链中氨基酸序列分析 （改进的Sanger法） 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成（离子交换层析） 离子交换层析分析蛋白质的氨基酸组分 N-端反应 水解肽链的方法及特征 裂解剂 裂解位点 胰蛋白酶 Lys、Arg（C） 胰凝乳蛋白酶 Phe、Tyr、Trp（C） 弹性蛋白酶 Ala、Gly、Ser、Val（C） 胃蛋白酶 Phe、Trp、Tyr（N） 溴化氰 Met（C） 羟胺 Asn—Gly Edman 降解法 组合对比 从核酸序列反推氨基酸序列 分离编码蛋白质的基因 DNA 序列分析 mRNA 序列分析 根据遗传密码反推蛋白质的序列 本章重点 概念：蛋白质的一级结构、蛋白质的二级结构、模体、蛋白质变性、蛋白质等电点（pI） 20种氨基酸的分类 α-螺旋的结构要点 GSH的生物学功能 蛋白质的理化性质 * 空间构象是蛋白质功能的基础 相似的空间结构有相似的功能 肌红蛋白/血红蛋白含有血红素辅基 血红素结构 肌红蛋白(myoglobin，Mb) 肌红蛋白是一个只有三级结构的单链蛋白质，有8段α-螺旋结构。 血红素分子中的两个丙酸侧链以离子键形式与肽链中的两个碱性氨基酸侧链上的正电荷相连，加之肽链中的F8组氨酸残基还与Fe2+形成配位结合，所以血红素辅基与蛋白质部分稳定结合。 血红蛋白(hemoglobin，Hb) 血红蛋白具有4个亚基组成的四级结构。 Hb各亚基的三级结构与Mb