补肾祛寒治汤对胶原诱导型关节炎大鼠血管内生长因子及骨形态发生蛋白―2表达影响.docVIP

补肾祛寒治汤对胶原诱导型关节炎大鼠血管内生长因子及骨形态发生蛋白―2表达影响 　　【摘 要】目的：观察补肾祛寒治?汤各剂量组对胶原诱导型关节炎（CIA）大鼠的治疗效果及对骨组织和滑膜组织中骨形态发生蛋白-2水平及血管内皮细胞生长因子水平的影响。方法：将74只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型组、甲氨蝶呤组、补肾祛寒治?汤稀释剂量组（小剂量组）、补肾祛寒治?汤正常剂量组（中剂量组）和补肾祛寒治?汤浓缩剂量组（大剂量组），各给药组连续给药28天，观察大鼠的一般情况、关节炎指数积分，荧光实时定量 PCR 技术测量大鼠膝关节骨组织及滑膜及 血管内皮细胞生长因子水平。结果：中剂量组与各组比较关节炎指数积分明显降低，骨形态发生蛋白-2表达水平明显提高，血管内皮细胞生长因子表达水平明显降低（均P 0.05）。结论：补肾祛寒治?汤治疗胶原诱导型关节炎大鼠有较好疗效，其作用机制可能是因为减少血管内皮细胞生长因子的表达，而减少血管翳形成，减轻了对骨的破坏；同时提高了骨组织及滑膜组织中骨形态发生蛋白-2的表达，从而增强了对骨的修复，促进骨损伤愈合。 　　【关键词】 关节炎，类风湿；补肾祛寒治?汤；骨形态发生蛋白-2；血管内皮生长因子；焦树德 　　补肾祛寒治?汤是已故中医名家焦树德教授治疗类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的经验方，经多年实践临床疗效满意[1]。本文旨在通过动物实验，探讨补肾祛寒治?汤治疗RA的作用机制。现将实验结果总结报告如下。 　　1 材料与仪器 　　1.1 实验动物 采用130～190 g SF级雄性 Wistar 大鼠74 只，由中国医学科学院实验动物中心提供，在中日友好医院SPF级动物室喂养，实验动物室许可证号为SYXK（京）（2005-0025）。 　　1.2 实验药品 甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）（上海医药集团有限公司信谊制药总厂生产），用无菌蒸馏水配置成 0.3 mg?ml-1水药液，即配即用。补肾祛寒治?汤用川续断15 g、补骨脂15 g、熟地20 g、制附片9 g、骨碎补18 g、淫羊藿10 g、白芍15 g、桂枝10 g、羌独活各10 g、威灵仙15 g、防风10 g、麻黄6 g、苍术10 g、知母12 g、炙山甲9 g、伸筋草20 g、赤芍10 g、松节15 g、地鳖虫10 g、川牛膝12 g等药物组成，共含生药 261 g。水煎过滤，小剂量组浓缩至 180 ml，生药浓度1.45 g?ml-1；中剂量组浓缩至90 ml，生药浓度2.9 g?ml-1；大剂量组浓缩至45 ml，生药浓度5.8 g?ml-1；4 ℃储存备用。 　　1.3 实验试剂 牛Ⅱ型胶原（sigma公司）；弗氏不完全佐剂（Freund’s Adjuvant incomplete，sigma公司生产）；RNA prep pure 动物组织总 RNA 提取试剂盒（TIANGEN公司生产）；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（ Roche公司生产）；Fast Start Universal SYBR Green Master（Roche公司生产）；用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物，由北京擎科生物技术有限公司合成，以GADPH作为内参照。设计引物序列如下：rGAPDHf：5CTCAACTACATGGTCTACATGTTCCAGTGCCCATTCTCAGCCTTGACT TCTTCAATTTAAGTTCTGTCCCTAC GTGTCCCTGTGCTGTCCATCCTGGCTTTACTGCTGTACCTCCTCCTATGTGCTCCCTTTGGTGA3。 　　1.4 实验仪器 低温冷冻离心机（北京医用离心机厂生产）；荧光定量 PCR仪（美国PE公司生产）。 　　2 方 法 　　2.1 动物分组及给药方法 SF级雄性Wistar大鼠74只，适应性喂养3天后，随机为正常对照组10只、CIA模型组12只、补肾祛寒治?汤小剂量组12只、补肾祛寒治?汤中剂量组14只、补肾祛寒治?汤大剂量组14只和MTX组12只。于实验前10天将牛Ⅱ型胶原溶于 0.1 mol?L-1醋酸中，2 mg?ml-1比例与弗氏完全佐剂1∶1充分混和乳化，除正常组外， 其余5组大鼠每只尾根部 1～2 cm皮下注射抗原 0.2 ml（每只200 μg），实验前3天后再次注射0.1 ml 加强免疫（每只100 μg）。至实验前1天，各造模组的大鼠双后肢都出现明显的发红肿胀，至膝关节甚至双前肢关节处亦有红肿，提示造模均成功。各实验组CIA大鼠造模成功后，正常组和CIA模型组用消毒饮用水灌胃（每次10 ml?kg-1），每天1次，连续28 天。甲