定向诱导的骨髓间充质干细胞对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的实验研究-神经病学专业论文.docxVIP

新疆医科大学硕士学位论文  PAGE 3 定向诱导的骨髓间充质干细胞对脊髓损伤大鼠神经功 能恢复的实验研究 研究生：张起顺 导师：张小宁教授 摘 要 目的： 探讨定向诱导的骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植对脊髓损伤大鼠神 经功能恢复的影响及其适宜移植时间。方法： 1）采用贴壁法培养、纯化 BMSCs： 取第 3 代的 BMSCs 加入含 bFGF、EGF 及 B27 的无血清复合神经诱导液进行诱导， 采用免疫细胞化学法以 nestin 鉴定神经干细胞，加入血清培养后，以 NF200、GFAP 鉴定分化的神经元样、星形胶质细胞样细胞。细胞移植前 3 天以 5 溴 2 脱氧尿嘧啶 核苷（Brdu）标记诱导后的 BMSCs；2）采用 Allen 法制作大鼠脊髓损伤模型，45 只脊髓损伤模型大鼠随机分为 3 组，每组 15 只，A、B 两组分别在模型制作后 1 周、 2 周两个时间点从原损伤部位移植 Brdu 标记的诱导后的 BMSCs，C 组为对照组， 从原损伤部位注入同等量的生理盐水。细胞移植后各组大鼠进行运动功能 BBB 评 分来判断神经功能恢复情况，并应用荧光免疫化学染色检测移植细胞的存活、分化 情况（Brdu 与 NF-200 双标记）及损伤部位神经纤维的再生情况。HE 染色观察脊髓 损伤区空洞的大小。结果： 1）在体外扩增培养的 BMSCs，增殖速度快，扩增能力 强：第三代的 BMSCs 形态均一，呈单层生长，胞体多为长梭形，呈漩涡状排列， 在含 bFGF、EGF 及 B27 的无血清复合神经诱导液中能分化为神经干细胞，加入血 清后能进一步分化为神经元样细胞及星形胶质细胞样细胞，相应表达神经元、星形 胶质细胞的标记物 NF200 及 GFAP；2）SCI 细胞移植术后 1～6 周，A、B、C 三组 动物后肢神经运动功能均有不同程度的恢复，A、B 两组的 BBB 评分均显著高于 C 组（P0.05)。A、B 两组免疫荧光显示，有大量 Brdu 和 Nestin 双标阳性细胞及部分 Brdu 和 NF200 双标阳性细胞充填于脊髓损伤区，并与宿主损害部近、远端密切相 接，同时可见明显的神经纤维再生，脊髓空洞面积明显小于 C 组（P0.05)。在 A 组上述改变更加显著。结论： 本实验中定向诱导的骨髓间充质干细胞具有神经干 细胞的生物学功能，且具有进一步分化能力；移植定向诱导的 BMSCs 可有效促进 脊髓损伤大鼠神经功能的恢复，其中，一周后移植效果优于两周后移植。 关键词： 脊髓损伤；骨髓间充质干细胞；移植  The study of transplantation of induced differentiated bone marrow mesenchymal stem cells on the neurological function recovery after spinal cord injury in rats Postgraduate: Zhang Qishun Supervisor: Prof. Zhang Xiaoning Abstract Objective: To investigate the effects and the suitable engraftment time of transplantation of oriented- induced bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) on the nerve function recovery after spinal cord injury (SCI) in rats. Methods: 1) BMSCs were cultured and purified by adherence method. The BMSCs at 3th passage were resuspended and induced in the DMEM/F12 medium without serum containing EGF, bFGF, B27. Immunocytochemistry was used to identify expression of nestin (maker for NSCs) . And then we added serum, and immunocytochemistry was used to identify expression of NF200 (maker for neuron) , GFAP (maker for astrocytes) . The oriented-induced BMS