丁型肝炎病毒(hdv)核酶对乙型肝炎病毒(hbv)抑制作用的研究-病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

汕头大学医学院博士学位论文 万方数据 目 录 中文摘要……………………………………………………………… 4 英文摘要……………………………………………………………… 8 论文正文 绪论………………………………………………………………11 第一部分 HBV 基因组序列分析及 HDV 核酶靶位点的选择……21 第二部分 HDV 核酶真核表达载体的构建………………………39 第三部分 HDV 核酶在细胞内对 HBV 抑制作用的研究………61 结论……………………………………………………………………81 在读期间发表论文……………………………………………………83 致谢……………………………………………………………………84 附：综述 丁型肝炎病毒核酶的结构特点与催化作用机制………………86 ３  丁型肝炎病毒（HDV）核酶对乙型肝炎病毒 （HBV）抑制作用的研究 摘 要 研究背景 核酶(ribozyme)是一类具有生物催化活性的 RNA 分子，可特异性结合并切割 靶 RNA，从而达到有效阻断基因表达的目的。目前发现的核酶有七种，包括 锤头状核酶、发卡状核酶、HDV 核酶、VS 核酶、RNase P 和Ⅰ类及Ⅱ类内 含子核酶。在核酶用于基因治疗的研究中，因为锤头状和发夹状核酶的片断 短，结构简单，催化活性较高，因此研究较多。但这两类核酶均来源于植物 类病毒，虽然在体外和细胞水平对其抑制基因表达的研究进行的比较深入， 但如何才能应用到临床仍存在巨大障碍，包括如何将其带入特定靶细胞，使 其在细胞内高效表达并能维持一定时间以及可调控表达等等问题。因此亟需 寻找新的途径和方法，以求能有所突破。 HDV 是目前发现的唯一一种在人类细胞内具有天然核酶活性的病毒，是由 1.7kb 组成的缺陷型负链 RNA 病毒，呈环状。其在细胞内的复制是通过滚环 机制进行的 RNA 指导的 RNA 复制，由核酶将长的转录物剪切成单位长度的 RNA。病毒核心需要乙肝病毒(HBV)的 HBsAg 进行包装，才能形成具有感 染活性的成熟病毒颗粒。所以 HDV 总是伴随 HBV 感染，否则 HDV 的感染 就是一个自限性的过程而不能形成慢性感染。因此 HDV 核酶应该更适应人 类细胞内的环境,而具有较高的核酶活性。HDV 核酶较锤头状和发夹状核酶 结构复杂，呈多个茎环组成的假结样结构，因而可能更具有稳定性。 由于 HDV 与 HBV 的特殊关系，更为我们提供了想象空间，可否利用这种关 系，使 HDV 核酶具有肝细胞特异性，尤其在用于乙型肝炎的基因治疗方面 发挥其独特的作用？目前这方面的研究很少，特别是细胞内的研究更少。我 们的主要目的是想探讨 HDV 核酶在细胞内对 HBV 复制及其抗原表达的抑制 作用如何，以求证其是否具有实际开发应用价值。 要保证核酶在细胞内能正常发挥催化作用，必须做到以下几点：① 核酶与 ４  其靶位点能有效结合；② 核酶在细胞内要高效表达，即达到足够的量；③ 核 酶要与其靶 RNA 共定位，即位于细胞的同一部位。因此我们将实验分为以 下几部分进行：第一部分 筛选合适的靶位点；第二部分 构建核酶高效真核 表达载体；第三部分 真核细胞转染。 方法 （1）提取 HepG2.2.15 细胞全基因组 DNA，PCR 扩增其基因组整合的 HBV 全基因组序列，产物经纯化后插入 pGEM-T 载体。 （2）从 NCBI database 中搜寻到 202 条不同类型的 HBV 全基因序列，用分 析软件（Vector NTI Suite 6）进行比对，按连续 15 个以上大于 90%相同碱基 的序列为标准，寻找高度保守序列。 （3）体外转录 HBV 全基因组 RNA。针对保守序列设计合成反义寡核苷酸 链(ODNs)，进行 RNase H 位点筛选实验。 （4）根据文献报道及选择的作用位点设计合成 HDV 反式作用核酶的 cDNA， 将其重组入 pGEM-4Z 质粒并体外转录合成 HDV 核酶。同法体外转录合成含 有靶位点的 RNA 片段。对 HDV 核酶的活性进行体外测定。 （5）设计合成 tRNAVal 启动子 cDNA，与 pUC19 质粒重组构建载体 ptV。然 后用 PCR 的方法将 HDV 核酶的 cDNA 与 ptV 重组，载体命名为 ptVHRz。 （6）以 ptVHRz 载体中的 HDV 核酶为模板，PCR 扩增后与真核表达载体 pcDNA3.0 重组，构建载体 pcDHRz。 （7）PCR 扩增 HDV 核酶 cDNA 序列，与 pSilencer 1.0–U6 载体重组构建载 体 pSURz。 （8）细胞转染：于转染前一天将 HepG2.2.15 细胞接种 24 孔培养板，按下 列分组进行细胞转染：Lipofectamine、pSURz、p