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过氧化氢对Hela肿瘤细胞毒性和衰老影响 　　[摘要] 目的 体外实验探讨过氧化氢对Hela肿瘤细胞毒性和衰老的影响。 方法 不同浓度的过氧化氢处理Hela细胞，CCK—8法检测细胞毒性，β—半乳糖苷酶染色法测定细胞衰老，测定平均荧光强度（MFI）反映细胞产生活性氧的水平。 结果 细胞增殖实验显示，400 μmol/L、800 μmol/L、1 600 μmol/L对体外培养的Hela细胞有不同程度的细胞毒性，最高达89.0%。过氧化氢处理后，细胞衰老率和活性氧产生水平随过氧化氢浓度升高而增高，呈现量效关系。 结论 过氧化氢对Hela细胞有明显的细胞毒性，还能诱导其衰老和影响活性氧的产生水平。 　　[关键词] 过氧化氢；Hela细胞；细胞增殖；细胞衰老；活性氧 　　[中图分类号] R—33 [文献标识码] A [文章编号] 1674—4721（2012）09（a）—0009—02 　　现有研究表明，过氧化氢是肿瘤发生、发展和死亡过程的关键事件，通过改变过氧化氢的含量或许能达到化学预防和治疗的目的[1]。本研究旨在探讨过氧化氢对体外Hela细胞的增殖和衰老的影响，为过氧化氢在肿瘤生长中的作用提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 　　1.1.1 试剂 小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），DMEM（GIBCO，上海英骏生物有限公司），胰酶细胞消化液（Beyotime），CCK—8试剂盒（碧云天生物技术研究所），活性氧检测试剂盒（碧云天生物技术研究所），细胞衰老β—半乳糖苷酶染色试剂盒（碧云天生物技术研究所）。 　　1.1.2 仪器 多功能酶标仪（Biotek），倒置显微镜（OLYMPUS），荧光显微镜（Leica），CO2培养箱（RSBiotech），超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）。 　　1.1.3 细胞株 人宫颈癌Hela细胞株，由广东医学院衰老研究所提供。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 将人宫颈癌细胞置于含10%小牛血清的DMEM培养液中，在 37℃，饱和湿度，5%CO2培养箱中培养。 　　1.2.2 过氧化氢处理肿瘤细胞 设置对照组和高、中、低3个剂量实验组，取对数期生长的肿瘤细胞按每孔10 000个细胞接种于48孔培养板，置37℃，5%CO2培养箱培养48 h，高、中、低剂量实验组分别加入不同浓度10 μL过氧化氢溶液，使其终浓度分别为1 600 μmol/L、800 μmol/L和400 μmol/L过氧化氢，对照组加入10 μL培养液，处理4 h。 　　1.2.3 过氧化氢对肿瘤细胞的细胞毒性试验 取“1.2.2”项处理后的细胞按试剂盒说明书用CCK—8法检测细胞毒性试验，细胞毒死率=（A对照组—A实验组）/A对照组。 　　1.2.4 过氧化氢处理后的衰老检测 取“1.2.2”项下处理后的细胞按试剂盒说明书用β—半乳糖苷酶染色，37℃孵育过夜，在荧光显微镜下观察结果。拍照计数100个细胞中β—半乳糖苷酶染色阳性细胞的百分比。 　　1.2.5 过氧化氢处理后的活性氧检测 取“1.2.2”项下处理的细胞按试剂盒说明书进行活性氧检测，以485 nm激发波长，528 nm发射波长检测荧光强度。平均荧光强度（MFI）反应活性氧水平[2]。 　　1.2.6 数据处理 实验数据以x±s表示，采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析，组间差异显著性比较采用t检验，P 0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 过氧化氢诱导氧化损伤的检测 　　结果见表1，各剂量组过氧化氢对体外培养的Hela细胞生长呈现出显著的抑制作用（P 0.01）。过氧化氢在400 μmol/L时的细胞毒死率为47.2%，在800 μmol/L时为55.9%，在1 600 μmol/L时达89.0%，呈量效关系。 　　2.2 过氧化氢处理后的衰老检测 　　结果见表1，实验组的β—半乳糖苷酶染色阳性率细胞数明显高于空白对照组（P 0.05或P 0.01），各剂量过氧化氢处理的阳性细胞率分别为32.28%、48.14%、69.47%。阳性细胞率随浓度增大而升高，呈现量效关系。 　　2.3 过氧化氢处理后的活性氧检测 　　结果见表1，各实验组过氧化氢对体外培养的Hela细胞的活性氧产生水平有明显的影响（P 0.05或P 0.01）。随着过氧化氢浓度的增高，肿瘤细胞产生的活性氧水平也增高，呈现量效关系。 　　3 讨论 　　本实验用过氧化氢体外处理Hela肿瘤细胞，细胞毒性试验结果显示，400 μmol/L过氧化氢的细胞毒死率为47.2%，1 600 μmol/L过氧化氢时达89.0%。细胞衰老率和活性氧产生水平也都随着过氧化氢浓度升高而增大，呈现量效关系。过氧化氢是需氧生物普遍具有的细胞氧代谢