作活细胞计数.PPTVIP

Chapter 3 细胞培养的基本方法;/;◆无菌操作 防止污染是细胞培养成功或失败的首要条件;总体要求： 动作准确敏捷 不用手触及已消毒物品 操作面布局合理 操作保持一定顺序 培养用瓶和吸管的放置 防止各种用液的交叉污染 不向操作员讲话或咳嗽;3.1.1 材料与设备器材的准备与消毒;3.1.2 超净台和培养室的消毒;3.1.3 洗手与着装;3.1.4 无菌操作 ;注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。 金属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。;无菌操作（续）;无菌操作（续）;超净台内物品的摆放布置：不要过多过杂；按照左右手的习惯依次摆放。;无菌操作（续）;无菌操作（续）;无菌操作（续）;无菌操作（续）;4.4 操作人员进入超净工作区前，必须在缓冲间穿衣、裤，戴帽子、手套等，并尽量避免作明显扰乱气流流型的动作。 4.5 使用工作台时，应提前 50min 打开紫外线灭菌灯处理净化工作区工作台表面积累的微生物，30min 后关闭灭菌灯，启动送风机。 4.6 工作完毕后，0.1%新洁尔灭擦拭净化工作台面，关闭送风机，打开紫外灯灭菌 30min， 最后关闭电源。;;接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中。;整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速。;;接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口;瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口;接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生;Chapter 3 细胞培养的基本方法;3.2.1 培养细胞的观察方法;1. 肉眼观察 ;苯酚红 Phenol red别名：酚红；苯酚磺酞；Phend-sulphonphthalein分子式：C19H1405S 相对分子质量：354.38 性状: 红色结晶性粉末。微溶于水，易溶于乙醇及碱溶液，不溶于三氯甲烷及醚。溶于稀碱溶液呈红色。用途：酸碱指示剂，pH值1.2（橙）～3.0(黄）,6.5（棕黄）～8.0(紫红）;生长良好的细胞， 细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。 相差显微镜观察时可见细胞部分细微结构。 若细胞生长状态不良 可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。;培养的CHO细胞;3.2.2 培养细胞的检测指标;Cell counting using a haemocytometer ;;细胞计数方法;细胞计数方法（续）;细胞数/毫升细胞悬液＝4大格细胞总数/4×10000×稀释倍数;培养细胞的检测指标;如何作？page73;◆ 生长曲线是培养细胞生物学特性的基本参数之一，是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标。 ◆ 常用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响！;2.1停止期或迟缓期（lag phase );2.1.3 出现迟缓期的原因;2.2 对数期（log phase) ;个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定，所以是研究细胞基本代谢的良好材料； 常在生产上用作种子，发酵的迟缓期缩短，提高经济效益； 增值噬菌体的最适寄主。;2.3 稳定期(stationary phase) ; 由于营养物质消耗，有害代谢产物累积和pH等环境变化，生长因子耗尽、营养物质比例失调，物理化学条件不适宜。;2.4 衰亡期(death phase) ;3. 细胞分裂指数;基本步骤： ;4. 细胞贴壁率;（1）取对数生长期细胞，用消化法制成细胞悬液，计数后按检测细胞生长曲线的接种细胞的原则，将细胞接种于培养瓶(浓度相对高些)。接种12～15瓶。 （2）每2小时取出一瓶细胞，倒掉培养液，然后加入胰酶消化已贴壁细胞，计数已贴壁细胞，用下面公式逐个计算每个时间上的贴壁率。每2小时一次，共观察24小时即12 次。 接种存活率%(贴壁率)=(贴壁存活细胞数/接种细胞数)×100%;5. MTT法测定细胞活力;操作步骤： （1）细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间） （2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；继续培养3小时。 （3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升／孔），将培养板置于微孔板振荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。 （4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570nm）。记录结果，绘制细胞生长曲线。 每隔24小时测量一个点，3个平行样品！;6. 克隆形成率;(1) 平板克隆形成试验 ;2