假单胞菌产弹性蛋白酶基因的克隆与表达-徐州工程学院学报.PDFVIP

第29卷第1期 徐州工程学院学报(自然科学版) 2014年3月 V01．29No．1 ofXuzhouInstituteof Journal SciencesEdition) Mar．2014 Technology(Natural 假单胞菌产弹性蛋白酶基因的克隆与表达 高兆建，王东星，王红建，苗倩钦 (徐州工程学院，江苏徐州 221008) 摘要：从假单胞菌(Pseudomonassp．)XZG36中克隆弹性蛋白酶基因，构建原核表达载体，实 现其在大肠杆菌(Escherichiacoli)中的高效表达，并对表达产物进行酶学性质分析，为微生物发酵 生产弹性蛋白酶奠定基础．以假单胞茵基因组DNA为模板，PCR扩增弹性蛋白酶基因，并将其开 亲和层析纯化后对弹性蛋白酶进行酶学性质分析．实验成功克隆了弹性蛋白酶基因，DNA基因片 段为1672 bp、编码497个氨基酸残基的多肽，与预计长度相符合；实现了其在E．coli中的高效表 000，与预期的一致； 达，表达量约占茵体总蛋白的20％；经SDS分析，相对分子质量为48 提纯后的表达蛋白SDS分析可见单一条带，纯度可达92％以上．表达蛋白具有良好活性． 关键词：弹性蛋白酶；基因克隆；表达；分析 弹性蛋白是一种结缔组织中不溶于水的纤维状蛋白，通常情况下不能被普通蛋白酶水解，但在高等动物 中可以被弹性蛋白酶特异性地水解．弹性蛋白酶是一种广谱蛋白水解酶，属于丝氨酸蛋白酶类，在多种蛋白 同时存在下能优先特异性地水解弹性蛋白[1]．目前对弹性蛋白酶应用研究比较多，在食品工业中，可以用来 水解动物肌腱、韧带组织等提高动物副产品的附加值，同时可用作肉类嫩化剂，嫩化难以消化的牛羊肉等[23； 在医药行业中，它可以用作治疗血栓的药物，防治动脉粥样硬化[3]．目前弹性蛋白酶的生产主要从胰脏中分 离获得，但由于生产成本较高，产量较低，不能满足需要．因此，通过克隆弹性蛋白酶基因，构建高效表达载 体，并在异源宿主细胞中通过基因工程技术高效表达重组弹性蛋白酶已经成为研究热点． 目前，弹性蛋白酶已从不同种属的微生物中分离获得，并进行了比较深入的研究．如Chang等[41将 Bacillus的碱性弹性蛋白酶基因克隆到B．subltils中，并得以表达，表达菌产酶为73U／mL；Kaneko等口1于 K一12 和B．subtilis DE 定点突变，提高了ale在B．subtilisDBl04及ale基因缺陷型突变株YaB C中的表达；2009年，Meng 酶，该酶最适环境为pill0．0；2009年，Lin等[81从铜绿假单胞菌(Pseudomonas U／m 白酶基因lasB，并在巴斯德毕赤酵母中表达，得到的重组弹性蛋白酶酶活为130L．虽然对弹性蛋白酶 基因及功能有了一定研究，但由于菌体生长速度慢、酶的表达产量低、分离纯化困难等因素的影响，目前基因 工程菌株还不能工业化生产弹性蛋白酶．针对大肠杆菌，以提高弹性蛋白酶产量为目的的酶基因的表达未见 报道． 本研究通过对前期从假单胞菌中克隆的弹性蛋白酶开放阅读框的克隆表达和重组酶学性质的研究，为 该酶更好地应用于工业生产奠定基础． 收稿日期：2013—12-18 基金项目：江苏省苏北科技发展计划项目(BC2013417)；徐州市科技计划项目(XFl2C005) 作者筒介：高兆建(1976一)，男，山东沂南人，副教授，博士，主要从事微生物资源开发与基因工程研究