采用ARDRA研究双孢蘑菇培养料后发酵过程中细菌群落结构.docVIP

采用ARDRA研究双孢蘑菇培养料后发酵过程中细菌群落结构 　　摘要：采用化学裂解和酶解相结合的方法, 以加入PVPP 的高盐缓冲液作为细胞裂解反应体系,用PEG-8000 进行DNA 沉淀,从双孢蘑菇堆肥后发酵的4个代表时期培养料样品中提取微生物总DNA，再以总DNA为模板，以专用引物F27和R1498进行PCR扩增，获得16S rDNA片段，经纯化后构建4个时期样品的细菌16S rDNA文库。试验结果表明，本试验获得的总DNA质量较好，采用PCR扩增可获得多个细菌、放线菌和真菌特异片段；细菌16S rDNA文库的目的片段插入效率在90％以上。 　　关键词：双孢蘑菇；培养料后发酵；细菌16S rDNA文库 　　中图分类号：S646.1A 　　 　　 “后发酵”是双孢蘑菇［Agaricus bisporus（Large） Sing.］培养料制备工艺中的1项关键环节，是通过室内控温的堆肥过程，使培养料成为利于双孢蘑菇菌丝生长的“选择性”栽培基质。在这一过程中，各种嗜热微生物的生理代谢和群落衍替决定了培养料的后发酵质量。但是至今为止，后发酵培养料的好坏还没有定量的判断指标，只能依靠技术员的经验采用感观指标（看、摸、闻等）进行判断。由于堆肥中有机质含量高达30%～70%，而且堆制过程中会产生大量的腐殖酸,影响DNA提取质量，制约后续的PCR扩增、限制性酶切以及杂交等反应［1］，从而制约采用分子生物学技术对培养料中微生物群落进行快速检测。本文在尝试建立从培养料中有效提取DNA的方法后，运用现代分子生物学方法，构建双孢蘑菇培养料“后发酵”4个时期的细菌16S rDNA文库，期望在构建文库的基础上对培养料中细菌群落结构进行初步的研究，为今后利用现代分子生态学方法快速、准确地动态检测培养料发酵过程中的微生物群落结构提供基础，同时为建立培养料后发酵的定量判断指标提供参考。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1供试双孢蘑菇培养料 　　双孢蘑菇培养料取自山东省九发食用菌股份有限公司的培养料制备车间。培养料配方见表1。 　　1.2试剂与仪器 　　PVPP(Polyvinyl polypyrrolidone)和PEG-8000(Polyethylene glycol)为美国Sigma公司产品, 蛋白酶K、Taq酶和溶菌酶分别为德国Merck公司、美国Promega公司和Genview公司产品, 溶壁酶为广东微生物研究所产品, DNA胶纯化回收试剂盒为维特洁生化技术有限公司产品，其他试剂均为国产分析纯或分子生物学等级。 　　主要仪器包括：匀浆器(Waring，美国)、PTC200-PCR扩增仪(MJ Research,美国)、核酸蛋白分析仪(Beckman，美国)和VDS-凝胶成像系统(Pharmacia，美国)。 　　 　　PCR 扩增引物序列和目的片段参见表2。 　　1.3方法 　　1.3.1培养料的采集 　　分别于对细菌群落组成具有代表性的4个时期采集培养料，从距培养料顶端约50 cm处取样约500 g，放入液氮中速冻后，于-20 ℃保存。 　　样品编号、环境温度、料温及取样对应时期见表3。 　　 　　1.3.2双孢蘑菇后发酵培养料样品的DNA提取 　　1.3.2.1样品前处理 　　称取25 g堆肥样品与100 mL无菌水混合，经匀浆器12000 r/min匀浆30 s，匀浆３次后，混合液于室温15000×g离心10 min，收集沉淀，于－20 ℃保存。 　　1.3.2.2样品洗涤 　　取0.6 g经前处理的样品，用4 mL的磷酸缓冲液（120 mmol/L磷酸钠，100 mmol/L EDTA，pH 8.0）洗涤后，于4 ℃ 12000×g离心10 min，去上清液，共洗涤3次，以去除胞外DNA和可溶性有机物质。 　　1.3.2.3DNA的提取 　　洗涤后的样品中加入2.2 mL裂解液（1.1 mol/L NaCl,150 mmol/L Tris-Cl,pH 8.0,1.5% CTAB,3 mmol/L EDTA,2.5 mg/mL溶菌酶，25 mg/mL溶壁酶）,37 ℃水浴1 h，每隔15～20 min轻轻振荡混匀一次；加入20 mg/mL蛋白酶K 20 μL，37 ℃水浴30 min,每隔15 min轻轻振荡混匀。酶解结束后,加入20% SDS 150 μL，0.15 g PVPP，再于65 ℃水浴1.5 h，每隔15～20 min轻轻振荡混匀，室温10000×g离心10 min,收集上清，转移至10 mL离心管中；沉淀再加入1.5 mL提取液（100 mmol/L Tris,100 mmol/L EDTA,200 mmol/L NaCl,2% PVPP,3% CTAB, pH