多肽与蛋白质HPLC分析和纯化.pdfVIP

第一章 多肽和蛋白质的反相HPLC 分析与纯化 反相高效液相色谱（RP-HPLC）已经成为一种分析和纯化生物分子广泛而可靠的方法。 RP-HPLC 在肽、蛋白质分析和纯化方面的重要作用在于它的分离度：RP-HPLC 能够分离具有 几乎同样序列的多肽，这不仅包括那些胰岛素消化物中的小肽，还包括更大的肽。仅相差一 个氨基酸残基的多肽通常可以用 RP-HPLC 分离，如图 1 所示的胰岛素变异物的分离。胰岛素 变异物的分子量都在 5300 左右,只是在氨基酸序列上有轻微的不同，即使这样，大部分的变 异物都可以用 RP-HPLC 分离。特别的是，反相色谱能分离人和兔的胰岛素，两者仅在于一个 亚甲基的不同——兔胰岛素有一个苏氨酸，而人胰岛素有一个丝氨酸！ RP-HPLC 对相近胰岛素变异物的分离 图 1.RP-HPLC 分离含有 一个 不同氨基酸的人和兔胰岛素。 色谱柱： VYDAC 214TP54 洗脱 液 ： 27-30%ACN+0.1%TFA，1.5mL/min，25min。 科学文献中已有很多用 RP-HPLC 分离相似多肽的例子。含有一个氧化蛋氨酸的胰岛素样 生长因子与其未氧化态类似物已得到分离，白细胞介素-2 突变蛋白也已经得到分离。在最 近的论文中，Kunitani 及其同事提出，RP-HPLC 的保留时间能提供保留在反相表面的蛋白质 的结构信息。他们研究了 30 种白细胞介素-2 突变蛋白，并分离了几乎相同的突变蛋白。含 氧化蛋氨酸的白介素与其自然状态得到分离，另外，单个氨基酸取代基也被与其自然状态分 离。他们得出结论：蛋白质的结构在反相分离中非常重要，同时，RP-HPLC 也能用来研究蛋 白质的结构。在该过程中，他们展示了 RP-HPLC 技术对相似多肽的分离能力。 RP-HPLC 用于分离酶消化产物中的肽碎片，纯化天然肽及合成肽。制备RP-HPLC 常常用 于纯化克及毫克量的合成肽。RP-HPLC 能用于分离血红蛋白变体，鉴别微粒种类，研究酶亚 基和细胞功能。RP-HPLC 还能纯化用于序列测定的微量级肽，并纯化治疗用的毫克级到千克 级生物技术衍生多肽。 反相 HPLC 广泛用于生物制药领域的蛋白质治疗制品的分析。通过分析蛋白质治疗制 品的酶消化物能识别蛋白质，并检测基因变化与蛋白质降解（脱酰氨和氧化）产物。用 RP-HPLC 分析完整蛋白质，能验证蛋白质的结构并测定降解产物。随着生物技术革命的扩展， 该色谱技术的应用也随之扩大。在过去的几年中，仅涉及 VYDAC 反相色谱柱方面的专利数目 就已呈现指数级的增长，如图2 （又见参考资料 74）。 1 用 Grace Vydac 反相 HPLC 色谱柱发表的专利数 图 2。美国专利局公布的 1984-2000 年间在专利中使用 VYDAC®反相 HPLC 色谱柱的专利数。 第二章 多肽与 RP-HPLC 色谱柱的作用机制 了解多肽与反相表面的作用机制对于理解RP-HPLC的多肽分离很重要。小分子的分离与分 子在流动相和疏水性的固定相之间的连续分配有关。但是多肽分子很大，很难分配到疏水相 之中；它们进入色谱柱后就吸附到疏水相的表面，直到有机调节剂的浓度达到临界浓度时才 会脱附（图3）。脱附后，多肽分子顺着柱子洗脱下来，它们与固定相表面就只有轻微的作用 了。 多肽/反相之间相互作用的吸附/脱附模型 图 3.流动相中的多肽进入色谱柱。多肽的“疏水脚”吸附到疏水性的反相材料表面，当有机调节剂 浓度升到临界浓度时，多肽就脱附下来了。 可以认为多肽是“坐在”固定相上面的，多肽分子的大部分都暴露在流动相中，只有 一部分—— “疏水脚”——与反相表面接触。RP-HPLC 是基于多肽之间 “疏水脚”的微小差 别来分离多肽的。“疏水脚”的不同源于氨基酸序列的不同与结构的不同。 2 多肽与疏水相之间吸附/脱附机制的关键 由于脱附多肽所需的有机调节剂分子的数目（Geng和Regnier称之为 “Z”值）非常精确， 所以脱附只在很狭窄的有机调节剂浓度范围内发生。这使得多肽只有在有机调节剂达到临界 浓度时才发生突然脱附，否则它们将全部被保留在色谱柱中（图4）。多肽脱附对精确浓度的 敏感性，是分离多肽时RP-HPLC具有选择性