微生物试验技术03——菌种保藏.doc

菌 种 保 藏 一、目的要求 学习与比较几种菌种保藏的方法。 二、基本原理 微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。 低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。 保藏方法大致可分为以下几种： 1、传代培养保藏法 又有斜面培养、穿刺培养、庖肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4~6℃冰箱内保存。 2、液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3、载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4、寄主保藏法用于上前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法（如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法）进行保藏。 5、冷冻保藏法 可分低温冰箱（－20 ~ －30℃，－50 ~ －80℃）、干冰酒精快速冻结（约－70℃）和液氮（－196℃）等保藏法。 6、冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度（－70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。 有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。 三、器 材 细菌、酵母菌、放线菌和霉菌； 肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐、干冰，95%酒精，10%盐酸，无水氯化钙。 灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与此同时100目筛子，油纸，滤纸条（0.5×1.2cm）,干燥器,真空泵,真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（－30℃），液氮冷冻保藏器。 四、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。 斜面低温保藏法将菌种接种在适宜的固体斜面增减基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2~8℃的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细胞保存2~4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。 液体石蜡保藏法 (1) 将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟，然后放在于40℃温箱中使水汽蒸发掉，备用。 (2) 将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。 (3) 用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。 (4) 将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长）。 此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1~2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。 3、滤纸保藏法 （1）将滤纸剪成0.5×1.2cm的小条，装入0.6×8cm的安瓿管中，每管1~2张，塞以棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟。 （2）将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使充分生长。 （3）取灭菌脱脂牛乳1~2ml滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。 （4）用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱再放回至安瓿管中，塞上棉塞。 （5）将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干。 （6）将棉花塞入管内，用火焰熔封，保存于低温下。 （7）需要使用菌种，复活培养时，可将安瓿管口在火焰上烧热，滴一滴冷