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重金属污染土壤微生物多样性研究进展 　　摘要 土壤微生物多样性的研究方法大体上可分为两类：基于生物或化学的方法和基于现代分子生物学技术的方法。综述了重金属污染下土壤的微生物多样性研究的多种经典方法的原理和不足，阐述了重金属污染土壤中微生物多样性的研究现状。并指出各种经典方法的综合运用是解决精确研究微生物多样性的有效途径。 　　关键词 重金属；土壤；微生物多样性；研究方法 　　中图分类号 S154.36文献标识码A文章编号1007-5739（2008）17-0174-02 　　 　　随着科技的日益发展，工业、农业中大量重金属向环境中渗透，导致土壤重金属污染日益严重，使其逐渐成为一个世界性的环境问题。微生物多样性代表着微生物群落的稳定性，它能较早地预测土壤养分及环境质量的变化过程，被认为是最有潜力的敏感性生物指标之一[1]。根据研究技术类型，土壤微生物多样性的研究方法大体上可分为两类：基于生物或化学的方法和基于现代分子生物学技术的方法，前者包含平板计数法（Plate counts）、碳素利用法(Biolog测试系统)、磷脂脂肪酸(PLFA/FAME)方法；后者包含基于PCR扩增后的核糖体DNA分析、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳（TGGE）、限制性片段长度多态性技术（RFLP）、限制性酶切分析（ARDRA）、末端限制性片段长度多态（T-RFLP）、随机扩增多态性DNA技术（RAPD）。现将常用的几种方法应用概况总结如下。 　　 　　1平板计数法在重金属污染土壤微生物多样性研究中的应用 　　 　　平板计数法是利用一定的培养基和方法选择所需要的微生物，通过复制与小生境尽可能一样的资源和条件，探测这个小生境里可能栖居的微生物类群，因而具备作微生物组成分析的优越性。腾应等[2]用平板计数法研究铅锌银尾矿污染区土壤微生物时发现，铅锌银尾矿污染区土壤微生物区系结构和数量发生了明显变化，土壤细菌、真菌及放线菌数量均出现显著降低，且三大微生物对重金属污染的敏感性大小也不一样，即放线菌 细菌真菌。张汉波[3]在研究铅锌矿渣堆对土壤微生物的影响时指出三大类群的微生物数量从大到小依次是细菌、放线菌和真菌，在空间上，大部分矿渣的上层比下层多。细菌和放线菌数量同样品可溶性锌含量呈明显负相关。细菌和放线菌的多样性指数同矿渣的水分呈显著正相关。 　　自然土壤生态环境下，许多土壤微生物处于贫营养状态，而培养基中充分的营养使大量的贫营养微生物不适宜生长，用传统的方法得到的多样性结果代表自然环境中微生物的多样性是非常片面的[4]。 　　 　　2碳素利用法(Biolog系统)在重金属污染土壤微生物多样性研究中的应用 　　 　　碳素利用法，通常又称BIOLOG系统，其基本原理是：微生物的存活、生长以及竞争需要不同形式的碳源，根据微生物对碳源利用模式差异来鉴定微生物群落功能多样性。碳素利用法借助于BIOLOG板，如革兰氏阴性板（BIOLOG GN）、革兰氏阳性板（BIOLOG GP）、生态板（ECO）等来实现。该测试系统已被广泛运用于土壤环境微生物的代谢功能多样性研究。 　　Muhammad等[5]运用BIOLOG ECO研究铅、镉污染土壤中微生物多样性，发现高水平的重金属能显著地影响微生物的种群结构。腾应等[2]利用Biolog测试尾矿区土壤微生物群落结构，结果显示该尾矿区微生物群落结构发生了相应变化，微生物群落代谢剖面及群落丰富度、多样性指数均显著低于非矿区土壤，表明尾矿区重金属污染引起了土壤微生物群落功能多样性的下降，减少了能利用有关碳源底物的微生物数量，降低了微生物对单一碳源底物的利用能力，最终导致土壤微生物群落功能结构多样性发生变化。 　　BIOLOG系统是目前揭示土壤微生物群落功能多样性的一种相对简单、快速的研究方法。但是也存在一些不足，该方法仅能鉴定快速生长的部分微生物成员，BIOLOG板微孔中碳源不能完全代表土壤生态系统中的实际碳源类型，而且BIOLOG板内是近中性的缓冲体系，高浓度的碳源及其生物毒性的指示剂均可能影响测试效果[6]。 　　 　　3磷酸脂肪酸法(PLFA)和脂肪酸甲酯法(FAME)在重金属污染土壤微生物多样性研究中的应用 　　 　　磷脂脂肪酸（Phospholipid fatty acid， PLFA）是构成活体生物细胞膜的重要组分，不同类群微生物能通过相应生化途径形成特定的PLFA，使部分PLFA总是出现在同一类群的微生物中，使其可作为区分活体微生物群落生物标记的基础。根据不同微生物特定磷脂脂肪酸标记物的种类和组成比例可鉴别土壤微生物群落结构多样性变化。Pennanen等[7]发现，在某冶炼厂长期重金属污染的针叶林土壤中真菌标记物（如18∶2ω6 ，9 和20∶4）的含量较低，随着