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高产纤维素酶菌株微波诱变及筛选研究 　　摘要：为了能够选育出一株高产纤维素酶的优良菌株，采用微波对其孢子悬液进行不同时间的辐照处理后，筛选出一株能高产纤维素酶的突变菌株B40 1，在最适产酶条件下，该突变菌株所产纤维素酶的滤纸酶活力和羧甲基纤维素酶活力分别是出发菌株的169.9%、110.0%。 　　关键字：里氏木霉；纤维素酶；微波诱变；酶活力 　　中图分类号：S852.6文献标识码：A文章编号：1007-273x（2014）03-0005-03 　　纤维素是地球上最丰富且最廉价的可再生资源之一，棉、木、麻及各种秸秆中均含有丰富的纤维素。目前已经得到的纤维素酶仍不能满足工业生产的需要，所以寻找新的适于再生能源需要的高催化活性、低成本的纤维素酶，依旧是此后的研究热点[1 3]。寻找和开发高产纤维素酶新菌种，选育出纤维素酶高产优良菌株是纤维素资源能否高效利用的关键问题，也是今后纤维素酶高产菌选育研究的一项重要任务，具有非常重要的生态效益、经济效益和社会意义[4 7]。 　　微波是一种高频电磁波，能够对一些极性分子如水分子、蛋白质、核苷酸、碳水化合物等产生快速震动的刺激作用，使细胞内DNA分子氢键和碱基堆积化学力受到损伤，引起DNA结构发生改变，从而发生遗传变异[8]。本试验以里氏木霉Rutc30为出发菌株，经微波辐照处理，最终选育出一株高产纤维素酶的里氏木霉突变菌株B40 1。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1菌种 里氏木霉菌株（TrichodermareeseiRutc30），由本实验室保存。 　　1.1.2主要仪器 ODELGSKP 01BII型隔水式电热恒温培养箱（湖北省黄石市医疗器械厂）；HZQ CV型空气振荡培养箱（哈尔滨市东明医疗仪器厂）；UV 6100型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；家用微波炉（额定输出功率800 W，脉冲频率2450 MHz）；ST16R型台式高速冷冻离心机Thermo（德国）。 　　1.1.3主要试剂 ①DNS试剂：3，5 二硝基水杨酸5.3 g，NaOH 9.9 g，酒石酸钾钠153 g，无水亚硫酸钠4.15 g，苯酚3.8 mL，蒸馏水708 mL；②葡萄糖标准溶液：称取葡萄糖0.036 g，蒸馏水定容至100 mL；③0.05 mol/mL，pH 4.8的檬酸 柠檬酸钠缓冲液：无水柠檬酸9.6 g，无水柠檬酸钠16.1186 g，蒸馏水定容至100 mL等。 　　1.1.4培养基 ①土豆培养基：马铃薯20 g，葡萄糖2 g，琼脂2 g，自来水定容至100 mL，pH自然；②分离培养基：KH2PO4 0.100 g，MgSO4?7H2O 0.025 g，（NH4）2SO4 1.000 g，CMC Na 1.000 g，去氧胆酸纳0.250 g，刚果红0.020 g，琼脂2.000 g，蒸馏水定容至100 mL，pH自然；③MM培养基：葡萄糖20 g，（NH4）2SO4 5.0 g，KH2PO415 g，MgSO4?7H2O20.6 g，CaCl2 0.453 1 g，CoCl2?6H20 3.7mg，FeSO4?7H2O 5 mg，ZnSO4?7H2O1.4mg，MnSO4?H2O1.6mg，加蒸馏水至1 000 mL，pH自然。 　　1.2方法 　　1.2.1葡萄糖标准曲线 取6支10 mL试管，分别加入相应试剂，于沸水浴中显色5 min，取出后用冰水迅速冷却，加入蒸馏水至5 mL，摇匀静置，于540 nm波长处测定光吸收值。以葡萄糖含量（mg/mL）为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线[9]。 　　1.2.2菌株的活化、培养与孢子悬液制备 刮取冷冻里氏木霉菌丝少许，转至盛有0.85%生理盐水的试管内，40 ℃水浴振荡复苏100 s；吸取适量菌液平板涂布，30 ℃恒温培养4 d；用pH为7.0的磷酸缓冲液冲洗下孢子，180 r/min，30℃恒温振荡30 min，使孢子充分活化并分散；用血球计数板进行计数，最后用相同浓度的生理盐水将孢子悬液稀释至106个/mL[8 11]。 　　1.2.3微波诱变 微波炉调至最大功率800 W，额定频率2 450 MHz。按不同的辐照时间对孢子悬浮液进行处理后，冰水浴1 min以消除微波热效应，取辐照后的孢子悬液涂布于分离培养基平板上，30 ℃恒温培养5d后进行菌落计数，同时计算微波不同辐照时间下的致死率[8，12]。致死率=（对照菌落数 处理菌落数）/对照菌落数×100%。 　　1.2.4突变菌株的筛选及扩大培养 筛选培养5 d后，挑选透明圈与菌落直径之比大于2.0（H/C2.0）、生长较快且产孢丰满的菌落，接种到MM培养基中，180 r/min，30 ℃恒温培养72 h。称取菌丝