靶向miRNA前体不同类型sgRNA的丰度及特异性-遗传.PDF

Hereditas (Beijing) 2018 年 7 月, 40(7): 561 ―571 研究报告 靶向miRNA 前体不同类型sgRNA 的丰度及 特异性评估 1 1 1 2 1 1 1 1 刘海龙 ，谌阳 ，高杨 ，周玲 ，韩晓松 ，赵长志 ，杨高娟 ，陈毅龙 ， 杨慧1 ，谢胜松1,2,3 1. 华中农业大学，农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，武汉 430070 2. 华中农业大学，动物医学院基础兽医系，武汉 430070 3. 华中农业大学，生猪健康养殖协同创新中心，武汉 430070 摘要 : CRISPR/Cas 技术能高效进行基因组定点编辑，但不同细菌来源或人工改造的Cas9 以及Cpf1 等核酸酶 识别的PAM (protospacer adjacent motif)有差异，因此不同的基因编辑核酸酶可能采用不同类型的sgRNAs(small guide RNAs) 。MicroRNAs (miRNAs)是一类调控性的小分子非编码RNAs ，为了研究miRNA 前体中是否可能存 在特异性高的 sgRNAs 靶点，本文利用本课题组前期开发的生物信息学软件 CRISPR-offinder ，对靶向28 645 条miRNA 前体的 11 种不同类型sgRNA 的丰度及特异性进行了分析，并利用CRISPR/Cas9 慢病毒技术构建了 猪miR-302/367 基因簇敲除细胞系，对构建的猪miRNA 敲除细胞系的效率进行了检测。结果表明，每个miRNA 前体中平均存在约8 种不同类型sgRNA 的靶点；通过评估靶向猪miRNA 前体sgRNA 的脱靶效应，发现其中 特异性高的sgRNA 仅占 18.2%；通过CRISPR/Cas9 慢病毒技术成功构建了猪miR-302/367 基因簇敲除细胞系， 发现通过该技术构建miRNA 敲除细胞系的效率为40% 。本研究为利用CRISPR/Cas 技术靶向敲除miRNA 提供 了重要资源。 关键词 : 猪；miRNA ；CRISPR/Cas9；sgRNA；敲除 收稿日期: 20 18−0 1−23; 修回日期: 20 18−04−27 基金项目: 国家重点研发计划干细胞及转化研究重点专项(编号：2016YFA0100203) ，中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(编号： 2662018JC002) 、转基因生物新品种培育重大专项(编号：2016Z004)和华中农业大学大学生科技创新基金(SRF)项目(编 号：2016048) 资助[Supported by the National Key Research and Development Program of China, Stem Cell and Translational Research (No.2016YFA0100203), the Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. 2662018JC002), the National Transgenic Pro- ject of China (No.2016Z-004) and Students Research Fund (No. 2016048)] 作者简介: 刘海龙，硕士研究生，专业方向：动物遗传育种与繁殖。E-mail : hailongliu@ 通讯作者: 谢胜松，博士，副教授，研究方向：基因编辑育种和繁殖。E-mail : ssxie@ DOI: 10.16288/j.yczz. 17-417 网络出版时间: 2018/6/6 11:29:45 URI: /kcms/detail/11.1913.R1129.005.html 562 Hereditas (Beijing) 2018 第40 卷 Assessing abundance and specificity of different types of sgR