lecture06 核酸测序技术及突变技术.ppt

1. Think about your final construct: Choose the vector you want to modify and envision your final, mutated construct (Figure 1; mutation shown in yellow). 2. Design your primers: Design inverse primers that overlap each other by 15 bp at their 5 ends and incorporate your desired deletion, substitution, or addition. Specific guidelines for mutagenesis primer design are described below. 3. Utilize the power of In-Fusion: Using an inverse PCR protocol, amplify the vector with your new primers. Perform the In-Fusion reaction using the PCR product. The linear DNA will re-circularize at the site of the 15 bp overlap and will also contain your mutagenic changes. Transform a portion of the In-Fusion reaction into Stellar Competent Cells according to the In-Fusion HD Cloning Plus protocol. 4. Obtain your final construct: Recover your mutant from the Stellar cells the following day. E 基因表达调控区的突变 Generation of Bidirectional Sets of Deletion Mutants by Digestion with BAL 31 Nuclease Generation of Sets of Nested DeletionMutants with Exonuclease Ill CRISPR/Cas9视频 /112757040 填写测序单： 写明样品类型、特性、编号、引物名称以及联系方式 /tech/cexu.htm 下一代测序技术 参考书：Next-Generation Genome Sequencing: Towards Personalized Medicine. Edited by Michal Janitz, 2008 WILEY-VCH Verlag GmbH Co. KGaA, Weinheim,ISBN: 978-3-527-32090-5 下一代测序技术原理 片断化的DNA两端加接头，随后运用不同的步骤来产生几百万个空间固定的PCR克隆阵列（polony）； 每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。 之后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都是系在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行。同样地，每个延伸所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行，来获取测序数据。酶拷贝和成像的持续反复构成了相邻的测序阅读片段。 下一代测序平台 3种广泛使用的商业化平台是Illumina的Genome Analyzer,罗氏454基因组测序仪以及AB Life Technologies 的SOLiD系统. 它们基本都是在20世纪90年代末被发明和开发出来, 在2005年前后商业化； Polonator G007是最近刚刚实现商业化的新设备, 该仪器最初由哈佛大学George Church 实验室开发, 现在由Dover Systems 公司制造。 Complete Genomics 公司最近推出了基于其专利技术的测序服务平台。 Illumina的Genome Analyzer 1. 文库制备：将基因组DNA打成几百个碱基（或更短）的小片段，在片段的两个末端加上接头(adapter)。 2. 产生DNA簇：利用专利的芯片，其表面连接有一层单链引物，DNA片段变成单链后通过与芯片表面的引物 碱基互补被一端“固定”在芯片上。另外一端（5’或 3’）随机和附近的另外一个引物互补，也被“固定” 住，形成“桥 (bridge)”。反复30轮扩增，每个单分子得到了1000倍扩增，成为单克隆DNA簇。DNA簇产生之后，扩增子被线性化，测序引物随后杂