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麻蝇全蛋白分析及凝集素纯化与鉴定 　　摘要以麻蝇成虫为材料,利用溶解度的不同,分别用硫酸铵、氯化钠、乙醇、氢氧化钠从脱脂麻蝇粉中分离、纯化获得清蛋白、小分子肽、球蛋白、醇溶蛋白和碱溶性蛋白等几类蛋白。测定蛋白质含量,并用亲和层析法纯化凝集素,通过SDS―PAGE凝胶电泳测定各类蛋白的相对分子质量。结果表明:脱脂麻蝇粉蛋白质的主要成分是清蛋白、球蛋白和小分子肽;蛋白质得率为44.94%,回收率为85.6%,凝集素的相对分子质量为82.9KD,血凝活力效价为1/104。 　　关键词麻蝇全蛋白凝集素 　　中图分类号:Q96文献标识码:A 　　 　　麻蝇是双翅目麻蝇科昆虫。据国内外对蝇蛆营养成分的分析显示,蝇蛆含粗蛋白59%～65%,超过粮食与农业组织(FAO)与世界卫生组织(WHO)提出的参考值(40%);其必需氨基酸与非必需氨基酸总量的比值(E/N)为0.78,超过FAO与WHO提出的参考值(0.6),还含有10%-16%的脂肪,8%-10%的甲壳素和多种维生素、微量元素等营养成分,是一种重要的饲料蛋白资源。VanderKnaap等人认为凝集素能够结合细菌细胞壁上的糖链结构,从而使细胞破壁,达到杀灭细菌细胞的作用。而且蝇蛆中的抗菌物质等活性蛋白质还有不同的重要药用价值。 　　目前,在昆虫蛋白质的提取制备方面,对蚕蛹、家蝇进行了一些研究,而麻蝇的全蛋白分析则很少,为此,本研究对麻蝇成虫蛋白质的提取制备方法和工艺参数等进行研究,并对麻蝇全蛋白分析及凝集素的纯化与鉴定,目的是为更进一步地规模化开发和利用蝇蛆打下基础,也对其它昆虫的蛋白质分析起到一定的借鉴作用。 　　 　　1 实验材料与方法 　　 　　1.1 实验材料 　　麻蝇的成虫(江西思达生物技术有限公司提供);兔血取自新西兰大白兔(南昌大学动物研究所提供)。试剂:标准蛋白Marker,琼脂糖凝胶-4B,牛血清白蛋白,丙烯酰胺、双丙烯酰胺、甘氨酸、硫酸铵等。仪器:索式提取器,紫外分光光度计,垂直板电泳仪,高速离心机等。 　　 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 麻蝇成虫的处理 　　(1)将成虫烘干,并粉碎成粉末状(过180目筛)。(2)索氏脂肪抽提法浸提麻蝇油脂:用滤纸将4g粉末分批包好,放入索式提取器内用石油醚抽提脂肪。4h后,脂肪已提取完全,并将抽提后的蝇粉烘干、冷却、称重、计算。抽脂后的麻蝇粉待用。(3)取1.2g抽脂后的麻蝇粉,加入20ml缓冲液搅拌均匀,在4℃下提取10h,用匀浆器匀浆后,再12000r/min离心15min,得上清液及剩余物,将剩余物重复上述操作。合并两上清液,得上清液26ml。取0.5ml上清液,用Bradford检测法测其蛋白质含量(所制作标准曲线见图1)。其余上清液和剩余物备用。 　　1.2.2 麻蝇成虫各蛋白组分的制备及其含量测定 　　(1)清蛋白和小分子肽(硫酸铵沉淀)。取25ml上清液,以盐析温度、pH值、硫酸铵浓度和时间为实验因素,采用L25(54)正交法进行实验(表1),以所得蛋白含量为指标,确定最佳工艺参数。 　　按表2加入硫酸铵至所需浓度,调pH值,在一定温度条件下盐析一定时间,离心,沉淀即为清蛋白,上清用旋转蒸发仪蒸发浓缩得小分子肽,测其蛋白含量。 　　(2)球蛋白。在经过蒸馏水提取后的剩余物中加入10%的氯化钠搅拌,静置,离心,取上清液,重提3次合并上清液。用旋转蒸发仪浓缩,测其蛋白含量。 　　(3)醇溶蛋白、碱溶蛋白和难溶蛋白。在经过氯化钠提取后的剩余物中依次加无水乙醇,2%的NaOH,提取和测定方法同(2),分别提取醇溶蛋白、碱溶蛋白和难溶蛋白,并分别测定其含量。所得残渣烘干称重。 　　上述所得蛋白全部用葡聚糖凝胶G-10过滤后放入透析袋中,用聚乙二醇6000浓缩到适当浓度备用。 　　1.2.3 麻蝇凝集素的纯化 　　(1)凝集素的纯化方法。取约10g新鲜成虫加入昆虫缓冲溶液(BIS)和少量的苯硫脲充分研磨,于4℃离心,重复3次,除去上层漂浮的脂肪层,保留上清液。将上清液与Sepharose-4B混合3h后装柱,用BIS以1ml/min的流量洗脱杂蛋白,至280nm吸光度小于0.02时停止,用0.2mol/L的D-半乳糖解吸,流量为1ml/min,收集吸收峰,并将层析后的溶液装入透析袋中透析,脱盐后冻干,得淡黄色凝集素,备用。 　　(2)血凝活力(HA)的测定。在V形血凝板上,用PBS缓冲液0.5ml对己纯化的麻蝇凝集素0.5ml进行倍比稀释,每管分别加入2%血球悬液0.5ml,振荡1min,在室温静置1h,显微镜观察凝血现象,测定其效价。效价定义为:最后一个发生可见凝集反应的样品稀释倍数的倒数。 　　1.2.4 SDS凝胶电泳鉴定麻蝇成虫各蛋白组分和凝集素。 　　电泳实验