全人源化抗结肠癌单链抗体基因的克隆和表达-维普.PDF

维普资讯 l7卷 5期 生 物 工 程 学 报 V0ll7 Nn．5 200【年 9月 Ⅲ ㈣ f Biotech~ l,ogy September 2001 全人源化抗结肠癌单链抗体基 因的克隆和表达 失建高 李官成 李跃辉 胡锦跃 周国华 葫志伟 孙去病 李小玲 (湖南 医科大学肿瘤研究所 长沙 410078) 摘 要 分离大肠痛患者外周血单个棱细胞 (PBMC)，在体外川灭活的大肠癌细胞再次致敏后 ，经 EBV转化 ，然后 Ⅲ有 稀释法克隆分泌抗大肠癌细胞抗体 的B细胞 ；多次 PCR扩增和克隆萁抗体l廿J变K基 因(V ／V DNA)，并州 编码 (Gl r) 的互补序列崖接成 ScFveDNA(V linker-V)．经酶切克隆^载倬 tESE5RF，使之呈现于噬菌体表面 通过用 3轮肿增细胞和止常人 PBMC淘选后 ，EMSA检测 80％的单克隆噬苗体抗体显示 厂很蛆的阳什反应 以 卜 结果初步说明：联台应用体外致敏、EBV转化 、PCR扩增和噬菌体呈现技术制备高亲和力全人源化的抗肿瘤抗体是 可行 的 关键词 大肠癌 噬菌体呈现 ，单链抗体 ，EBV转化 ．体外致敏 ，聚合酶链反应 中图分类号 R7396 文献标识码 A 文章编号 1090-3061f2001)05—0526-05 人源化单链抗体 (SeFv)在肿瘤临床应用 的最大 取的策略是应用 EBV转化技术 ，体外转化经抗原致 优点是避免了鼠源抗体应用于人体 内产生的HAMA 敏的肿瘤病人外周血单个核细胞 【PBMC)，从而获得 反应(人抗鼠抗体反应)．以及分子量小 ，容易进人实 永生化的、分泌高亲和力 的、抗大肠癌 B细胞 克隆． 体瘤 。噬菌体人抗体库技术为快速选择特异性抗体 克隆其免疫球 蛋 白可变 区基因 ，以此在体 外经过 提供了简便而高效 的可操作系统 。 目前 ，通过该 DNA重组技术恢复 B细胞 内高亲和力的v ，v．原 技术已获得多株针对不同抗原 的特异性噬菌体人单 始的配对 ．并展示在噬菌体表面。 链抗 体。国 内关 于抗 肿 瘤单链 抗体 的报 道很 1 材料和方法 多 ．但大多是通过基 因工程技术把 鼠源杂交瘤 抗体改造成小分子单链抗体，仍属 鼠源单链抗体。 1．1 材料 96年，我室已开始从事全人源化 的基因工程抗体研 1．1．1 细胞株 、细菌及质粒 ：人大肠癌细胞株为 究．用体外致敏的大肠癌患者 PBMC构建 了抗大肠 HRT-18，缄猴淋巴母细胞样细胞株为 B95—8，均 由本 癌的噬菌体抗体库 ，但发现筛选得到 的噬菌体单链 室保存 ，培养在含 10％新生小牛血清 RPMI一1640培 抗体与肿瘤抗原亲和力较低 ．这可能与构建 的噬 养 基 中。E coilMC1061、E．m “K802、E coil 菌体抗体库质量有关 其可能原因包括 ：第一是抗 K9IKan及丝状噬菌体 fUSE5均 由美 国 Yale大学 体库容量小，约 1旷；理论上 ，包括各种抗原特异性的 GJtren教授惠赠 库容须在 1O 以上，而 目前达到此库容量在技术要 1．1．2 培养基 ：胎牛血清 (FCS)及新生小牛血清 求上是 比较困难的，如果抗体库库容不大 ，就有可能 (NBS)为杭州 四季青公司产 品．细胞及细胞菌培养 筛选不到理想的人单克隆抗体。第二是由于分泌高 基及琼脂糖 均为 Gibeo／BRL公 司产 品，rhlL-2．谷氨 亲和力的特异性抗体的B细胞数量较少，在基因操