东亚三角涡虫DjTRAF3基因的表达及功能分析-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

摘 要 扁 形动 物 是 在动 物 演 化 进程 中 是 首次 出 现 两 侧对 称 、三胚 层 的 类 群，而东 亚 三角 涡 虫(Dujesia japonica)是 扁 形 动物 门 涡虫 纲 的 代表 动 物 ， 且涡 虫 具 有很 强 的再 生 能 力， 因 而 其 已成 为 研 究进 化 ， 发 育和 再 生 机制 的 模 式 动物 。 目 前，已 在 从低 等 到 高 等如 线 虫 、果 蝇 、斑 马鱼 、鼠 、人 等 的 多 种生 物体 内 中发 现 了TRAF3基 因 的存 在 ，在哺 乳 动 物 中TRAF3广 泛 分布 于 体内 的 各 个组 织 ，例 如 心 、脾 、 肺 、 肝脏 和 肠 等， 与 TNFR和TLRs结 合参 与 生 物体 的 免 疫 ， 影 响细 胞 的 生存 、增 殖、分 化 和 死亡 。目 前 已知 ，TRAF3可 以 与TBK-1结合 诱 导 产 生 IFN ， 参 与 Toll 样 受 体 信 号 通 路 ； 还 可 以 通 过 对 NIK 的 负 调 控 来 已 知 NF-κB信 号通 路 ，此 外 还 发现 它 在 非TLRs信 号 通路 依 赖 型的 抗 病 毒 过程 中 也扮 演 重要 角 色 。 从 本 实 验 室 cDNA 文 库 中 得 到 一 编 码 为 12118-283 的 基 因 ， 序 列 全 长 746bp，其 最 大 开放 阅 读框 为 564bp，编 码 的蛋 白 质 含 187 个 氨 基酸 ， 蛋 白分 子 量大 小 约 为 21.3KDa。 蛋 白序 列 经 NCBI 的 BLAST 比 对 发 现 该蛋 白 包 含一 个 MATH（ meprin and TRAF-C homology） superfamily 结 构 域 也即 TRAF 结 构域 ， 预 测其 底 物 结 合区 位 于 98-159 位 氨基 酸 区 域内 ， 与 其 他动 物 类 群的 TRAF3 氨基 酸 序 列 比 对发 现 ， 该蛋 白 与 果 蝇相 似 度 约 23%， 与 斑马 鱼 相 似度 约 36%，与 哺 乳 动物 相 似度 高 达 35-39%，对 各物 种 的 TRAF3 蛋 白序 列 中 TRAF 结 构域 进 行 比对 ， 结 果 显示 TRAF3 蛋 白 中 的 TRAF 结 构域 具 有 高度 保 守 性 。 此 外进 化 分 析结 果 表 明 ，DjTRAF3 和 果蝇 的 TRAF3 聚 群 ，位 于 进 化树 的 基 部， 属 于较 原 始 类型 。 通过 Northern 杂 交， 确定 DjTRAF3 基 因 存 在于 东 亚 三角 涡 虫 中 ，并 检 测 了 其大 小。杂 交 结 果 显 示有 一 大 小 750bp 左 右的 信 号 带，大 小 与 已有 cDNA 吻 合 。 通 过 原 位 杂 交 的 方 法 得 出 结 果 ： 无 论 在 涡 虫 整 体 还 是 在 再 生 各 个 时 期 ， DjTRAF3 基 因 的 阳性 信 号一 致 出 现在 整 个 肠 上。同 时 ，整 体 原 位 切 片结 果 显 示： DjTRAF3 基 因 的 阳性 信 号也 在 整 个肠 上 ，推 测该 基 因 参与 涡 虫 的 免疫 过 程 。利 用 LPS 诱 导 涡 虫 ， 并 对 诱 导 不 同 时 间 段 的 涡 虫 进 行 Real-time PCR 检 测 ， Real-time PCR 结 果 显 示 ， LPS 诱 导 后 DjTRAF3 基 因 的 表达 量 出 现 明显 起 伏， 表 明涡 虫 DjTRAF3 基 因 参与 了 涡 虫免 疫 过 程 的调 控 。 构 建 PET28a-DjTRAF3 及 pGEX-DjTRAF3 原 核表 达 载 体 ，通 过 IPTG 普通 诱 导和 自 诱 导两 种 体 系 对融 合 蛋 白诱 导 表 达 ，并 进 行 western blotting 鉴 定 及 I 山东理工大学硕士学位论文 摘要 纯 化 ，SDS电 泳 结果 显 示 ，两者 均 表 达出 一 大 小约 为 21kDa 的条 带 ，经 Western blotting 鉴 定 证 实表 达 出 的确 为 DjTRAF3 蛋 白 ，但 PET28a-DjTRAF3 重 组 载 体 表 达 量 更 高 ， 表 达 操 作 亦 更 简 便 ， 因 而 进 一 步 用 PET28a-DjTRAF3 大 量表 达 ， 并利 用 得 到 的蛋 白 进 行抑 菌 实 验 ，结 果 显示 DjTRAF3 蛋 白有 一 定 程 度的 抑 菌 作用 。 关键词：东亚三角涡虫；DjTRAF3；原位杂交；原核表达；West