羊种布鲁氏菌NN1202与LA1105株OPM25与OPM31蛋白B细胞抗原表位分析.docVIP

羊种布鲁氏菌NN1202与LA1105株OPM25与OPM31蛋白B细胞抗原表位分析 　　摘要： 应用PCR技术对羊种布鲁氏菌NN1202和LA1105株的[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因进行扩增、克隆和测序。测序结果显示，NN1202和LA1105株的[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因在布鲁氏菌种间高度保守。应用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法分析OMP25和OMP31蛋白的α-螺旋、β-折叠、转角区域和卷曲区域；应用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法分析蛋白的氨基酸亲水性、蛋白柔性区域、溶剂表面可及性和抗原指数。对各方法的结果综合分析，OMP25蛋白的27～34、59～65、69～75、101～107、148～154、182～189、197～202区域以及OMP31蛋白的25～32、50～58、63～70、102～111、125～130、166～173、176～183区域可能是优势B细胞抗原表位。 　　关键词： 布鲁氏菌；OMP25；OMP31；抗原表位 　　中图分类号： S858.26 文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2015）08-0038-04 　　布鲁氏菌是一种感染人、家畜、野生动物等60多种动物的人兽共患病原菌，根据宿主和致病性的差异，分为羊种布鲁氏菌（Brucella melitensis）、牛种布鲁氏菌（B. abortus）、猪种布鲁氏菌（B.suis）、绵羊附睾种布鲁氏菌（B. ovis）、犬种布鲁氏菌（B. canis）和沙林鼠种布鲁氏菌（B. neotomae）6个种；此外，还从海洋动物中分离到在致病性和分子特征上有别于前6种的海豚布鲁氏菌（B. cetacease）和海豹布鲁氏菌（B. pinnipediae） [1]。在这8种布鲁氏菌中，以羊种布鲁氏菌对人的致病性最强。布鲁氏菌的外膜由外膜蛋白、脂多糖和磷脂层构成。外膜蛋白为一类与毒力密切相关的免疫原性蛋白 [2-3]，其中，分子量分别为25 ku（OMP25）和31 ku（OMP31）的2种外膜蛋白是布鲁氏菌的主要外膜蛋白 [4-5]。OMP25蛋白和OPM31蛋白免疫小鼠后，能分别诱导产生IgG2a 和IgG1类型的抗体，是一种抗原免疫保护蛋白 [6-7]。Bowden等证实OMP31的单克隆抗体与其诱导产生的抗体存在竞争抑制现象，表明OMP31存在抗原表位 [8]。本研究拟对广西分离的2株羊种布鲁氏菌NN1202、LA1105菌株的[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因进行克隆、测序，运用生物信息学技术对二者的B细胞抗原表位进行分析，为后续的合成肽疫苗研究提供依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 菌株 羊种布鲁氏菌NN1202和LA1105菌株由广西兽医研究所细菌研究室分离、鉴定和保存 [9]。羊种布氏菌5号疫苗为PCR扩增阳性对照菌株。 　　1.1.2 试剂 布氏琼脂粉购自英国Oxiod公司；马血清购自美国Thermo公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒及PCR反应所用试剂购自北京康为世纪生物科技有限公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1OMP25和OMP31 基因的PCR扩增和克隆 取保存的羊种布鲁氏菌NN1202株和LA1105株冻干菌种，每支菌种加入0.2 mL无菌水溶解，接种棒蘸取菌液接种于含10%马血清布氏琼脂斜面培养基，置于37 ℃的CO2培养箱培养 72 h。用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA，以细菌DNA为模板对[WTBX][WTBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因进行PCR扩增。以羊种布氏菌5号疫苗为阳性对照。PCR反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，60 ℃（57 ℃） 1 min，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 10 min。扩增预期片段分别为650 bp和750 bp。引物序列分别为PM25-F：5′-GAATTCATGCGCACTCTTAAGTCTCTC-3′；OPM25-R：5′-GTCGACTTAGAACTTGTAGCCGATGCC-3′；OPM31 -F：5′-GCGAATTCATGAAGTCCGTAATT-3′；OPM31-R：5′-GCCTCGAGTTAGAACTTGTAGTT-3。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。 　　DNA胶回收试剂盒纯化、回收目的片段后，与pMD-18T载体4 ℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α，PCR鉴定正确的阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司测序。