毒素-抗毒素系统与结核分枝杆菌持留性的相关研究-病原生物学专业论文.docxVIP

Related research between toxin-antitoxin system and the persister of Mycobacterium tuberculosis A Dissertation Submitted to Shihezi University In Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Medicine By Shen Aiping （Pathogenic Microbiology） Supervisor: Prof. Yuan Li June, 2015  石河子大学学位论文独创 性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除 文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体 ，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。 …名:中!均 时间:均年 J 月 7 日 使用授权声明 本人完全了解石河子大学有关保留 、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主 管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。 有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编 出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 月份 材 AJ bhv 签 生 研 时间:洲叫月7 日 玄 名 签 导 时间 : t() It!if 6 月 7 日 摘 要 目的：本研究拟通过构建结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统缺失株，初步研究其在不同培 养条件下对结核分枝杆菌生存能力的影响，并对毒素-抗毒素系统与结核分枝杆菌持留 性相关性进行初步探讨。 方法：1. 结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统缺失株的构建及鉴定。首先以聚合酶链反应 （PCR）分别从 H37Rv 标准株和 PUC-19K 质粒上扩增出目的基因的同源臂及卡那霉素 抗性基因 kan 基因；然后应用融合 PCR 技术将目的基因的同源臂和 kan 基因进行杂交拼 接，获得目的融合片段，将该融合片段克隆于 pMD-19T (simple)载体形成自杀质粒 pMD-19T-ΔmazEF -kan 和自杀质粒 pMD-19T-ΔrelBE-kan，并将自杀质粒分别转化至大肠 杆菌 DH5a 中；最后利用电穿孔技术将自杀质粒电转至 H37Rv 感受态细胞中；在卡那霉 素抗性改良罗氏培养基上筛选出 H37RvΔmazEF 和 H37RvΔrelBE 缺失突变株单个菌落， 提取阳性菌株全基因组 DNA 为模板，PCR 扩增克隆片段并测序，并对所获得 H37RvΔmazEF 和 H37RvΔrelBE 缺失突变株进行遗传稳定性检测。 2. 结核分枝杆菌 H37RvΔMazEF 缺失突变株的生长表型和在不同培养条件下生存能力的初步检测。分别 对野生型和缺失株进行抗酸染色，镜下观察菌株形态学的改变；分别在低氧和营养缺乏 的培养基中培养缺失株和野生株，并在不同的时间点对菌落进行计数，比较野生株和缺 失株在应激条件下，生存能力是否存在差异。3.分别用 H37Rv、H37RvΔmazEF3、 H37RvΔmazEF6 和 H37RvΔmazEF9 菌株感染小鼠巨噬细胞 RAW264.7，通过 CFU 计数 初步检测结核分枝杆菌感染巨噬细胞后细菌的生存能力；利用流式细胞仪 CELLQest 和 WinMDl2.9 Version 软件检测巨噬细胞感染后的凋亡情况。 结果：经传代 15 代后，再次测序，未发生回复性突变，得到具有遗传稳定性的 H37RvΔMazEF 和 H37RvΔRelBE 基因缺失株。抗酸染色显示，H37RvΔmazEF 菌株较野 生菌株其形态短小；同时，CFU 计数结果显示缺失菌株生长缓慢。细菌感染巨噬细胞后， 缺失株在巨噬细胞内的生存能力低于野生菌株，且 H37RvΔmazEF 菌株感染组，巨噬细 胞的凋亡率高于 H37Rv 菌株感染组。 结论：mazEF 毒素-抗毒素系统有助于结核分枝杆菌在应激环境下的持留生存。研究结 果表明了结核分枝杆菌感染机体后的持留性及其潜伏感染是多因素相互作用的结果，确 切的感染机制有待于进一步研究。 关键词：结核分枝杆菌， mazEF 基因，relBE 基因，同源重组，持留性 I  Abstract Objective By constructing deletion strains of toxin-antitoxin system in Mycobacterium tuberculosis, we studied its abil